分离感觉神经元并与自然杀伤细胞共培养

摘要

来源：Ahmadi, A., 等 解析自然杀伤细胞与伤害性感受神经元之间的相互作用。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频介绍了通过酶消化、机械解离和梯度离心法分离背根神经节（DRG）神经元的过程。将DRG细胞与自然杀伤细胞在细胞外基质上进行共培养，以研究免疫细胞与感觉神经元之间的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. NK细胞的分离、培养与刺激

1. 通过将lox-stop-lox-白喉毒素小鼠（DTAfl/fl）与TRPV1cre/wt小鼠杂交，获得伤害性感受神经元完整（同窝对照；TRPV1wt::DTAfl/wt）和损伤（TRPV1cre::DTAfl/wt）的小鼠。
2. 使用二氧化碳吸入法处死一只未经处理的同窝对照小鼠（TRPV1wt::DTAfl/wt）。
3. 将脾脏收集至含有500 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL微量离心管中。
4. 使用研磨杵匀浆脾脏组织。
5. 用1 mL无菌PBS稀释细胞悬液。
6. 将混合液通过50 µm细胞筛网过滤至15 mL锥形管中。
7. 用无菌PBS补足体积至10 mL。
8. 取10 µL样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。
9. 离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。
10. 将细胞重悬于补充培养基的RPMI 1640培养基中，调整浓度为10⁸ 个细胞/mL。
11. 按照制造商说明书，使用小鼠NK细胞分离试剂盒通过磁珠分选法纯化脾脏自然杀伤（NK）细胞。通过流式细胞术确认NK细胞纯度。
12. 取10 µL样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。
13. 离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。
14. 将NK细胞重悬于含IL-2和IL-15的补充RPMI 1640培养基中。
15. 在96孔U型底板中以2 × 10⁶ 个NK细胞/mL的密度培养48小时。

2. 背根神经节神经元的分离与培养

1. 在NK细胞刺激结束前24 h（步骤1.15），用100 µL/孔的层粘连蛋白（laminin，1 ng/mL）包被96孔板，37 °C孵育45 min。
2. 孵育后，移除溶液，并在生物安全柜中让各孔自然风干。
3. 采用CO2吸入法处死伤害感受性神经元完整（同窝对照，TRPV1wt::DTAfl/wt）或已消融（TRPV1cre::DTAfl/wt）的小鼠。
   注意：相较于颈椎脱位法，CO2吸入法更优，因其可避免损伤与背根神经节（DRG，Dorsal root ganglion）相连的脊神经。
4. 将小鼠俯卧固定于解剖板上，提起皮肤，沿背部正中线切开皮肤。
5. 剪断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分离。
6. 沿脊柱两侧向头侧方向剪开肌肉和肋骨，直至颅底。
7. 用剪刀在枕寰关节处剪断脊柱。
8. 去除脊柱上的肌肉和脂肪组织。
9. 将椎骨固定并打开，取出脊髓以暴露背根神经节（DRG）。在椎间孔内寻找DRG，其通过背根与脊髓相连，但与脑膜分离。
10. 将分离的DRG收集至含有10 mL冰上预冷的含补充物DMEM培养基的15 mL离心管中。
11. 离心处理（200 × g，5 min，室温），弃去上清液。
12. 加入含胶原酶IV（Collagenase IV，1 mg/mL）和中性蛋白酶II（Dispase II，2.4 U/mL）的PBS溶液250 µL。
13. 将DRG与胶原酶IV/中性蛋白酶II（C/D）溶液在37 °C、轻度震荡条件下孵育80 min。若合并多个小鼠的神经节，应保持每神经节125 µL C/D溶液的比例。
14. 为灭活酶活性，加入5 mL含补充物的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基。
15. 离心（200 × g，5 min），用移液器小心吸除上清液。
16. 为避免非特异性细胞损失，残留约100 µL上清液。
17. 加入1 mL含补充物的DMEM培养基。
18. 使用移液器及三支口径依次减小的玻璃巴斯德移液管，轻柔吹打DRG组织（每支移液管约上下吹打10次），制成单细胞悬液。
19. 在生物安全柜中，将牛血清白蛋白（BSA）用无菌PBS（磷酸盐缓冲液，Phosphate buffered saline）稀释至终浓度15%。分装为1 mL每份，−20 °C保存。
20. 在15 mL离心管中制备BSA梯度：先加入2 mL无菌PBS，再缓慢将1 mL 15% BSA溶液沿管底加入。操作时应轻柔取出移液器，避免破坏梯度。
21. 使用P200移液器，将吹打后的神经节悬液（含神经元）缓慢沿管壁加入梯度液中。
22. 对含神经元的BSA梯度液进行离心（200 × g，12 min，室温）。离心机的加速度和减速度均设为最低档。
    注意：离心后，神经元将沉降至管底，而细胞碎片则被截留在BSA梯度层中。
23. 用移液器小心吸除全部上清液。
24. 用500 µL Neurobasal培养基重悬细胞。
25. 将10⁴个神经元/孔接种至经层粘连蛋白包被的平底96孔板中（每孔200 µL Neurobasal培养基）。
    注意：平均而言，每只小鼠可接种约8个孔。
26. 将神经元在37 °C培养过夜，以促进贴壁。

3. 共培养

1. 缓慢移除神经元培养物中的Neurobasal培养基。
2. 经IL-2和IL-15刺激48小时后（参见步骤1.14–1.15），重悬NK细胞，并将10⁵个NK细胞/孔加入神经元培养物中（96孔平底板）。
   注意：平均而言，每只小鼠可获得足够填充约6个孔的细胞。
3. 在添加补充物的Neurobasal MX培养基中共同培养细胞（37 °C，48 h）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
牛血清白蛋白（BSA）培养级	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 抗小鼠 NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
细胞筛（50 μm）	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
胶原酶 IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep 小鼠 NK 细胞分离试剂盒	Sigma	Cat no: CLS2595
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	Cat no: C0130
胎牛血清（FBS）	Sigma	Cat no: 806552
玻璃巴斯德吸管	Sigma	Cat no: 470236-274
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）	VWR	Cat no: 02-0131
层粘连蛋白	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-谷氨酰胺	Gibco	Cat no: A14867-01
小鼠重组 IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
小鼠重组 IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
神经生长因子（NGF）	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal 培养基	PeproTech	Cat no: 450-51-10
青霉素和链霉素	PeproTech	Cat no: 210-15
研磨杵	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Biolegend	Cat no: 108732	克隆 PK136
RPMI 1640 培养基	Biolegend	Cat no: 137606	克隆 29A1.4
镊子和解剖工具	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U 型底 96 孔板	Biolegend	Cat no: 101319
活率染料 eFlour-780	Becton Dickinson
CO2 培养箱
解剖显微镜