原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

摘要

来源：Er, S.，等。在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中研究预先形成的纤维诱导的α-突触核蛋白聚集。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了从小鼠胚胎中脑分离和培养多巴胺能神经元的过程。分离出的腹侧中脑组织通过酶消化法进行解离。获得的多巴胺能神经元被收集并转移至多孔板内的微岛结构中。细胞在多巴胺能神经元培养基中孵育，以维持其在微岛内的高密度生长状态。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备

1. 使用 0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 原霉素（primocin）配制多巴胺能神经元培养基（DPM），并以杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）补足。混合后过滤 DPM。将 DPM 储存于 4 °C，每份仅限预热一次。
   注意：DPM 中不应含有胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF），因其会减少多巴胺能神经元中 α-突触核蛋白的积聚。
2. 准备经硅化处理的玻璃移液管，其表面极度疏水，从而在胚胎神经元初始操作过程中最大限度减少细胞黏附于管壁及细胞损失。
   1. 将 10 mL 硅化液加入 1 L 蒸馏水中，在 2 L 容器中搅拌混合。将玻璃移液管浸入硅化液中 15 分钟。
   2. 用蒸馏水冲洗移液管 3–5 次。在室温下过夜自然晾干，或在 100–120 °C 的加热无菌空间中干燥 1–2 小时以加快干燥过程。
   3. 将移液管装入密封的高压灭菌袋中，通过标准高压灭菌法进行灭菌。
3. 准备经多聚-L-鸟氨酸（PO）包被的 96 孔板（透明底），向将用于接种神经元的孔中央加入 60 μL PO 溶液，板边缘至少留出一整行或一整列孔不加，以避免边缘效应。包被后的 96 孔板可在 4 °C 过夜或在室温下放置 4 小时。
4. 接种细胞前，彻底吸除 PO 溶液，并用 100 μL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗孔内三次。吸除 1× PBS 后，打开板盖使孔内完全干燥。
   注意：可回收使用过的 PO 溶液，经过滤后可重复使用。同一 PO 溶液最多可重复使用两次。
5. 向已包被的孔中加入 50 μL DPM。用 100 μL 塑料吸头从孔中吸除 DPM，同时以环形动作轻轻刮擦孔底，去除孔边缘区域的包被层，使每个孔中央保留一个 PO 包被的小岛。
6. 在超净工作台内，向每个包被小岛中央加入 10 μL DPM，以形成微小岛结构。
   注意：覆盖 DPM 的微小岛板可在细胞分离过程中置于超净工作台内保存 1–2 小时。

2. 分离胚胎第13.5天（E13.5）小鼠胚胎的腹侧中脑底部

1. 解剖前，将一个10 cm的培养皿中加入杜尔贝科缓冲液，并置于冰上备用。
2. 根据机构指南处死一只E13.5的妊娠雌性小鼠。将小鼠平躺仰卧放置，用70%乙醇喷洒其前腹部。用镊子提起子宫上方的皮肤，使用手术剪剪开切口以暴露子宫。
3. 小心取出子宫，并将其放入先前准备好的、置于冰上的培养皿中。
4. 在室温下的超净工作台中，使用手术剪小心地将胚胎从子宫中取出。用镊子去除胚胎上的所有胎盘残留物，并将其转移至另一个盛有杜尔贝科缓冲液的10 cm培养皿中。
5. 使用解剖镊或针头，从图1A中标记的黑箭头位置处剪下头部的后半部分，并将剪下的组织与胚胎其余部分分离（图1B）。
6. 将剪下组织的尾端朝向观察者（图1C），从尾侧向头侧轻轻切开（图1D）。从头侧切口下方约0.5 mm处，切取一个2 mm²–3 mm²大小的区域，如图1E所示。
7. 收集腹侧中脑底部组织（见图1F），放入一个空的1.5 mL微量离心管中。将微量离心管置于冰上，直至所有中脑底部组织均收集完毕。
   注意：也可在完成所有胚胎脑组织解剖后，使用1 mL移液器收集中脑底部组织。

3. 以96孔板形式建立E13.5小鼠胚胎的原代中脑培养

1. 将所有胚胎的中脑腹侧板收集至同一1.5 mL离心管后，吸除残留的Dulbecco缓冲液，并用500 μL含Ca2+的Dulbecco缓冲液洗涤组织块三次⁺，Mg2⁺无钙镁Hank's平衡盐溶液（HBSS）
2. 移除 HBSS，向管中加入 500 μL 0.5% 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 孵育期间，将1.5 mL胎牛血清（FBS）在37 °C预热，向FBS中加入30 μL DNase I，并混匀。同时，将一支硅化玻璃移液管的管口进行火焰抛光，确保其孔口无锐利边缘，且直径与1 mL移液器吸头大小相近。
   注意： 作为替代方案，可使用低吸附性1 mL移液枪头进行吹打。然而，硅化玻璃移液管似乎能获得最佳效果。
4. 步骤3.2的孵育结束后，立即向部分消化的组织中加入500 μL FBS/DNase混合液。使用玻璃移液管在FBS/胰蛋白酶混合液中吹打组织，直至组织解离成微小的、几乎不可见的颗粒。吹打过程中避免产生气泡。
5. 让残留颗粒依靠重力沉降至微量离心管底部。避免吸取底部沉淀物，将上清液转移至一个空的15 mL圆锥形聚丙烯管中。
6. 将步骤 3.3 中的 FBS/DNase I（98:2）用 1,000 μL HBSS 稀释，得到 FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）。通过移液器吹打混匀。取 1,000 μL 新配制的混合液加入微量离心管中剩余的颗粒物中。再次吹打混悬，并重复步骤 3.5.
7. 重复上一步骤一次，以用尽所有FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）。
8. 当所有上清液均收集至15 mL离心管中后（来自步骤 3.5、3.7 和 3.8)，使用台式离心机以100 × g离心约3 mL上清液5分钟。弃去上清液，注意不要触碰底部的细胞沉淀。
9. 将2 mL DPM加入离心管中重悬细胞沉淀，100 × g离心5 min。弃去上清液，重复洗涤2次，以尽量减少沉淀细胞中的碎片。
   注意： 始终使用新鲜配制并预热的DPM培养神经元。洗涤步骤中DPM无需新鲜配制，但应预先加热至37 °C。
10. 用新鲜的温DPM稀释细胞，并转移至微量离心管中。DPM的稀释体积取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，从十个胚胎获得的细胞可用150 μL的DPM进行稀释。
11. 将10 μL DPM中的细胞转移至微量离心管中，与10 μL 0.4%台盼蓝染液混匀，计数活细胞（即， 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数拒染台盼蓝的细胞。
    注意： 每孔接种30,000个细胞，以获得每孔约1,000个多巴胺能神经元。若细胞密度高于每6 μL含30,000个细胞，则在接种前用DPM进一步稀释细胞，确保接种体积不少于6 μL。
12. 不要触碰孔板底部，移除在步骤中创建的微岛上的 DPM 1.6.
13. 为获得各孔中可重复的细胞密度，铺板前需通过轻柔吹打混匀细胞。使用1–10 μL微量移液器，将6 μL细胞悬液加至每孔中央，对应先前微岛的位置。
14. 在培养板边缘的空孔中加入150 μL水或1×PBS，以减少含神经元培养物的孔中液体的蒸发。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。₂ 1小时。
15. 孵育1小时后，从孵育箱中取出培养板，向每孔细胞中加入100 μL DPM，然后放回孵育箱中。
16. 接种后两天（体外培养第2天，DIV2），移除25 μL培养基，加入75 μL新鲜DPM，使最终培养基体积达到150 μL，并尽量避免蒸发。
17. 在DIV5时，用新鲜DPM更换一半培养基（即移除75 μL并加入75 μL新鲜DPM）。DIV5之后不再进行任何培养基更换。

结果

图1：E13.5小鼠胚胎中脑腹侧板的解剖。（A）头部后部的切割位置以黑色箭头和白色虚线标出。（B）该组织块已从胚胎其余部分分离。被移除的组织块以圆圈标出。（C）将组织块旋转90°，使后端朝向观察者。（D）从黑色箭头处沿尾侧至头侧方向（白色虚线标示）打开组织。（E）在开口下方0.5 mm–1 mm处，切取2 mm²–4 mm²的区域（黑色线条标示）。（F）分离出中脑腹侧板（黑色虚线方框标示）。比例尺 = 1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝染液	Gibco，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	15250061
15 ml CELLSTAR 聚丙烯管	Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森	188261
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	赫尔辛基大学生物技术研究所媒体厨房
5 M NaOH	N/A	N/A	赫尔辛基大学生物技术研究所媒体厨房
96孔视图板（黑色）	PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	6005182
99.5% 乙醇（EtOH）	Altia Oyj，芬兰拉贾迈基	N/A
AquaSil 硅化液	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司	TS-42799
经高压灭菌的1.5 ml 微型离心管	N/A	N/A	媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所
Bioruptor 超声破碎仪	比利时列日 Diagenode	B01020001
Ca2+，Mg2+ 无钙镁亨克氏平衡盐溶液（HBSS）	Gibco，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	14175-053
CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包	N/A	N/A	免费开源软件
离心机 5702	Eppendorf AG，德国汉堡	5702000019
CO2 培养箱	HeraCell，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	N/A
计数室	BioRad公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	1450015
DeltaVision 超高分辨率显微镜，配备气浮台与机柜	美国马萨诸塞州波士顿，GE医疗集团生命科学部	29254706
脱氧核糖核酸酶-I（Dnase I）	罗氏公司，巴塞尔，瑞士	22098700
DMEM/F12	Gibco，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	21331–020
杜氏缓冲液	N/A	N/A	媒体配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
胎牛血清（FBS）	Gibco，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	10500056
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	G8769
磷酸盐缓冲液（PBS）	N/A	N/A	赫尔辛基大学生物技术研究所媒体厨房
Primocin	美国加利福尼亚州圣地亚哥，InvivoGen	ant-pm-1, ant-pm-2
聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P4957
Triton X-100	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	11332481001
胰蛋白酶	MP Biomedicals，Valiant 公司，中国山东烟台	2199700