原代胚胎小鼠中脑多巴胺神经元的分离和培养

Abstract

来源:Er， S. 等人。研究原代胚胎小鼠中脑多巴胺神经元中预先形成的原纤维诱导的 α-突触核蛋白积累。J. Vis. Exp.（2020 年）。

该视频演示了从小鼠胚胎的中脑中分离和培养多巴胺神经元的过程。孤立的腹侧中脑底板使用酶解离。收获产生的多巴胺神经元并转移到多孔板内的微岛中。将细胞与多巴胺神经元培养基一起孵育，以将细胞保持在微岛内的高密度。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 准备工作

1. 用 0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 初生霉素制备多巴胺神经元培养基 （DPM），并用 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 完成。混合成分后过滤 DPM。将 DPM 储存在 4 °C 下，每个等分试样仅加热一次><。 注意:DPM 不应含有神经胶质细胞系衍生生长因子 （GDNF），因为它会减少多巴胺神经元中α-突触核蛋白的积累。
2. 准备具有极强疏水性的硅化玻璃移液器，从而在胚胎神经元的初始处理过程中最大限度地减少对表面的附着和细胞的损失。
   1. 将 10 mL 硅化液加入 1 L 蒸馏水中，并在 2 L 容器中搅拌混合。将玻璃移液器浸入硅化溶液中 15 分钟。
   2. 用蒸馏水冲洗移液器 3-5 次。在室温 （RT） 下干燥移液器过夜或在 100-120 °C 加热的无菌空间中干燥 1-2 小时，以加快干燥速度。
   3. 通过在密封的高压灭菌袋中进行标准高压灭菌对移液器进行消毒。
3. 通过在 96 孔板的中间孔中加入 60 μL PO 溶液来制备具有透明底部的聚-L-鸟氨酸 （PO） 涂层的 96 孔板，用于神经元的....

Results

图 1:从 E13.5 小鼠胚胎中解剖中脑底。 （A） 头部后躯的切割位置用黑色箭头和白色虚线标记。（B） 从胚胎的其余部分取出该碎片。移除的棋子被圈出。（C） 将作品旋转 90°，使其面向观察者的后部。（D） 该块从黑色箭头打开，从尾部到颅骨（用白色虚线标记）。（E） 从开口下方 0.5 mm–1 mm 处，切割 2 mm² –4 mm² 区域（用黑线标记）。（F） 腹侧中脑底被隔离（用黑色虚线方块标记）。比例尺 = 1 毫米。

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Materials