原代胚胎小鼠中脑多巴胺神经元的分离和培养

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 准备工作

1. 用 0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 初生霉素制备多巴胺神经元培养基 （DPM），并用 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 完成。混合成分后过滤 DPM。将 DPM 储存在 4 °C 下，每个等分试样仅加热一次><。 注意:DPM 不应含有神经胶质细胞系衍生生长因子 （GDNF），因为它会减少多巴胺神经元中α-突触核蛋白的积累。
2. 准备具有极强疏水性的硅化玻璃移液器，从而在胚胎神经元的初始处理过程中最大限度地减少对表面的附着和细胞的损失。
   1. 将 10 mL 硅化液加入 1 L 蒸馏水中，并在 2 L 容器中搅拌混合。将玻璃移液器浸入硅化溶液中 15 分钟。
   2. 用蒸馏水冲洗移液器 3-5 次。在室温 （RT） 下干燥移液器过夜或在 100-120 °C 加热的无菌空间中干燥 1-2 小时，以加快干燥速度。
   3. 通过在密封的高压灭菌袋中进行标准高压灭菌对移液器进行消毒。
3. 通过在 96 孔板的中间孔中加入 60 μL PO 溶液来制备具有透明底部的聚-L-鸟氨酸 （PO） 涂层的 96 孔板，用于神经元的接种，在板的边缘留下至少一行/一列孔以避免边缘效应。将涂层板在 4 °C 或 RT 下放置 4 小时。
4. 在铺板细胞之前，完全吸出 PO 并用 100 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞三次。从孔中吸出 1x PBS，并保持板盖打开以完全干燥><。 注意:可以收集用过的 PO 并对其进行过滤以供重复使用。对于同一 PO 解决方案，可以重复此作两次。
5. 向先前包被的孔中加入 50 μL DPM。用 100 μL 塑料吸头从孔中吸出 DPM，同时以圆周运动刮擦孔底部，以去除每个孔周边的涂层。一个 PO 涂层的岛将保留在井的中间。
6. 在层流罩下，在每个包被岛的中间添加 10 μL DPM><，以形成微岛。 注意: 在细胞分离过程中，带有 DPM 覆盖的微岛的板可以在层流罩下保持 1-2 小时

2. 从胚胎第 13.5 天 （E13.5） 小鼠胚胎中分离腹侧中脑底

1. 解剖前，用 Dulbecco 缓冲液填充 10 厘米培养皿并将其保存在冰上。
2. 根据该机构的指南对 E13.5 怀孕的雌性小鼠实施安乐死。将鼠标平放在其背上，并用 70% 乙醇喷洒前体。用镊子提起子宫上方的皮肤，然后用手术剪刀切开以露出子宫。
3. 小心地取出子宫，并将其放入先前准备好的冰培养皿中。
4. 在 RT 的层层罩下使用手术剪刀，小心地从子宫中取出胚胎。用镊子从胚胎中去除所有胎盘残留物，并将它们放入装有 Dulbecco 缓冲液的新 10 厘米培养皿中。
5. 使用解剖钳或针头，从图 1A 中用黑色箭头标记的地方切下头部的后半部分。将切块从胚胎的其余部分中取出（图 1B）。
6. 将切割块的后部朝向观察者（图 1C），并从尾部到颅部轻轻切开（图 1D）。从颅口下方 0.5 mm 处，切出 2 mm² –3 mm² 的区域，如图 1E 所示。
7. 将腹侧中脑底（参见图 1F）收集在一个空的 1.5 mL 微量离心管中。将微量离心管放在冰上，直到所有中脑底部都聚集在其中><。 注意: 或者，在解剖所有胚胎脑后，可以用 1 mL 微量移液器收集中脑底。

3. 从 96 孔板格式的 E13.5 小鼠胚胎中建立原代胚胎中脑培养物

在同一根
1. 1.5 mL 试管中收集所有胚胎的中脑底后，去除残留的 Dulbecco 缓冲液，并用 500 μL Ca 2 ⁺ 、不含 Mg 2 ⁺ 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 洗涤组织块三次。
2. 去除 HBSS 并向试管中加入 500 μL 0.5% 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 孵育过程中，在 37 °C 下加热 1.5 mL 胎牛血清 （FBS），向 FBS 中加入 30 μL DNase I，然后混合。此外，对硅化玻璃移液器的尖端进行火抛光。确保孔没有锋利的边缘，并且与 1 mL 微量移液器吸头的大小大致相同><。 注意:作为替代方案，可以使用低粘附力 1 mL 微量移液器吸头进行研磨。然而，硅化玻璃移液器似乎给出了最好的结果。
4. 步骤 3.2 中的孵育结束后，立即向部分消化的组织中加入 500 μL FBS/DNase 混合物。使用玻璃移液管研磨 FBS/胰蛋白酶混合物中的组织。研磨直到组织解离成微小的、几乎看不见的颗粒。研磨过程中避免气泡。
5. 让剩余的颗粒在重力作用下沉淀在微量离心管的底部。无需移液底部的沉淀物，将上清液收集到空的 15 mL 锥形聚丙烯管中。
6. 用 1,000 μL HBSS 稀释步骤 3.3 中的 FBS/DNase I （98:2），以获得 FBS/DNase-I/HBSS （49:1:50）。通过上下移液混合。将 1,000 μL 新混合物添加到微量离心管中的剩余颗粒中。再次研磨并重复步骤 3.5。
7. 再次重复上一步以用完所有 FBS/DNase-I/HBSS （49:1:50）。
将所有
8. 上清液收集在 15 mL 试管内（来自步骤 3.5、3.7 和 3.8）后，使用台式离心机以 100 x g 的速度旋转上清液 （~3 mL），持续 5 分钟。去除上清液，不要接触底部的沉淀细胞。
9. 向试管中加入 2 mL DPM 洗涤细胞沉淀，并以 100 x g 的速度旋转 5 分钟。去除上清液并重复洗涤 2 次，以尽量减少沉淀细胞中的碎片。
   注意: 始终对培养的神经元使用新鲜、加热的 DPM。对于洗涤步骤，DPM 不必是新鲜的，但应预热至 37 °C。
10. 用新鲜、温热的 DPM 稀释细胞，并将其转移到微量离心管中。用于稀释的 DPM 量取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，使用 150 μL 的 DPM 稀释从 10 个胚胎中获得的细胞。
11. 将 DPM 中的 10 μL 细胞转移到微量离心管中。将它们与 10 μL 的 0.4% 台盼蓝染色剂混合。使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对活细胞（即台盼蓝阴性）进行计数。
    注意:每孔使用 30,000 个细胞进行铺板，以获得每孔 ~1,000 个多巴胺神经元。如果细胞密度高于每 6 μL ~30,000 个细胞，则在铺板前用 DPM 进一步稀释细胞，使接种体积不小于 6 μL。
12. 在不接触孔底部的情况下，从步骤 1.6 中创建的微岛中取出 DPM。
13. 为了在每个孔中获得可重现的细胞密度，在孔中铺板之前，通过轻轻移液混合细胞。使用 1–10 μL 微量移液器，将 6 μL 细胞添加到孔中间，每个先前微岛的位置。
14. 用 150 μL 水或 1x PBS 填充板边缘的空孔，以尽量减少从含有神经元培养物的孔中蒸发。将板在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 1 小时。
15. 1 小时后，从培养箱中取出板，向每个装有细胞的孔中加入 100 μL DPM，然后将其放回培养箱中。
16. 铺板后两天（体外第 2 天或 DIV2），去除 25 μL 并加入 75 μL 新鲜 DPM，使最终培养基体积达到 150 μL，并尽可能避免蒸发。
在
17. DIV5 处用新鲜 DPM 交换一半的培养基（即，去除 75 μL 并加入 75 μL 新鲜 DPM）。请勿在 DIV5 之后执行任何介质更改。

图 1:从 E13.5 小鼠胚胎中解剖中脑底。 （A） 头部后躯的切割位置用黑色箭头和白色虚线标记。（B） 从胚胎的其余部分取出该碎片。移除的棋子被圈出。（C） 将作品旋转 90°，使其面向观察者的后部。（D） 该块从黑色箭头打开，从尾部到颅骨（用白色虚线标记）。（E） 从开口下方 0.5 mm–1 mm 处，切割 2 mm2 –4 mm2 区域（用黑线标记）。（F） 腹侧中脑底被隔离（用黑色虚线方块标记）。比例尺 = 1 毫米。