本文介绍了一种用于围手术期和重症监护相关急性肾损伤的有力模型。通过心脏骤停诱导的全身低灌注，几乎可以复制临床急性肾损伤的组织学和功能变化。
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本文内容
摘要
摘要
急性肾损伤（AKI）是危重疾病中常见且致死率极高的并发症，其死亡率高1-4，最常见原因为全身性低灌注5,6。在啮齿类动物模型中成功复制全身性低灌注一直存在诸多困难7-9,9,10。采用局部缺血的模型反复显示出无法转化为临床实际的结果，而允许实现全身低灌注的大动物模型又无法获得小鼠所具备的完整基因操作工具集11,12。然而，近年来出现了一种小鼠心脏骤停与心肺复苏模型，可被改造用于模拟AKI13。该模型能够可靠地再现临床AKI中观察到的生理、功能、解剖及组织学结局，具有快速可重复性，并兼具小鼠外科模型的诸多显著优势，包括可进行基因操作、相对于大动物成本较低以及操作简便。本课题组已在此模型应用方面积累了丰富经验，用于评估AKI中的多种器官特异性结局14,15
方案
所述所有操作均遵循美国国立卫生研究院关于研究中动物护理和使用的指南，并且所有动物实验方案均已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 手术准备
- 称量小鼠体重。本方案适用于体重在 20 至 25 g 之间的 C57BL/6 小鼠。使用 3-4% 异氟烷在诱导箱中诱导麻醉，随后以 1.5-2.5% 异氟烷在空气/氧气混合气体中维持麻醉。
- 为小鼠眼睛涂抹润滑剂，并将其仰卧位固定在加热垫上。用胶带固定四肢。后肢脚掌可固定于中立位，但前肢脚掌应尽可能贴近胸壁固定，以便在胸外按压时充分扩展胸壁。
- 涂抹润滑剂后插入直肠温度探头。通过连接电子温度控制器（Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL）的加热垫和加热灯控制体温，设定温度维持在 37.0°C。由于在无血流状态下动物体内可能形成温度梯度，因此在目标器官附近测量和控制温度至关重要。
- 使用 2.5 cm 长的 22 号特氟龙导管（Insyte-W, BD, Franklin NJ）和弯头引导器（Frova Introducer, Cook Medical, Bloomington IN）的截短远端进行气管插管。其他气管插管方法也可接受，但使用弯头引导器可使颈部保持轻度伸展的合适位置，从而优化静脉导管置入时的手术视野。将气管导管接头用缝线环扎固定于门齿，并施加轻微张力以在胸外按压期间固定头部。
- 使用设定为 140 μL 潮气量、150 次/分钟呼吸频率的啮齿类动物呼吸机对小鼠进行机械通气。由于本方案始终用于 20-25 g 的动物，无需根据体重调整参数。切勿加深麻醉。切勿设置呼吸机施加呼气末正压，因其会妨碍复苏操作。
- 采用无菌操作技术并在手术显微镜下，将预先冲洗过的 PE-10 导管置入颈静脉。可选择任一侧，但建议使用靠近操作者的一侧，以减少胸外按压或其他操作过程中导管移位的风险。术毕在切口边缘注入 0.1 mL 的 0.5% 布比卡因以控制术后疼痛。
- 使用氰基丙烯酸酯外科粘合剂将 PE-10 导管固定于皮肤切口处。
- 置入皮下心电图（EKG）电极并连接至监测设备。准确布设信号通路并最大化信号强度对于复苏成功至关重要。确保所有导线均固定于操作台面，尽量减少信号交叉，并尽量减少信号通路中的绝缘体（如空心针头或绞合导线中的空气）。可从厂家购买或在实验室自制实心针连接非绞合导联线。连接后，优化心电图在监护仪上的显示信号。
2. 心脏骤停
- 确保小鼠处于正常体温状态，即直肠温度为 36.5°C - 37.5°C。静脉注射 40 μL 室温的 0.5 M 氯化钾溶液，观察心电图（EKG）上出现等电线形。在体重 20–25 g 范围内，无需根据体重调整剂量。开始记录心脏停搏计时器。
- 断开呼吸机，停止麻醉气体供应，关闭加热垫及任何可能干扰心电图监测的产生电子噪声的设备，并在小鼠体表覆盖一层隔热毯。
- 在心脏停搏期间每分钟记录一次体温。如有必要，可使用加热灯将核心体温提升至正常体温范围。在心脏停搏期间，准备复苏所需的耗材和设备（例如肾上腺素注射器）。使用检查清单有助于确保复苏过程不间断，这对存活至关重要。
- 心脏停搏持续 7 分钟 30 秒后，重新连接呼吸机，并将呼吸频率提高至 180 次/分钟，潮气量保持在停搏前设定值。
- 在第 8 分钟时开始胸外按压，频率为 300 次/分钟。可通过心电图上的运动伪影判断心肺复苏（CPR）的按压频率。按压应使用食指，在剑突上方 5 mm 处、略偏中线左侧的位置进行。按压深度应达到前后径的 1/3 至 1/2，且每次按压后必须允许胸廓完全回弹。手指位置和最佳按压力度至关重要。该模型中复苏失败几乎总是由于心肺复苏操作不充分所致。
- 在心肺复苏开始后的前 30 秒内，输注 0.5 mL 浓度稀释至 15 μg/mL 的肾上腺素溶液，总剂量为 8–12 μg。密切观察心电图，判断是否恢复自主循环（ROSC）。在按压伪影之间可见窄的QRS波群。ROSC 通常发生在开始心肺复苏后 90 秒至 2 分钟之间。若在 3 分钟内仍未出现 ROSC，则终止复苏。ROSC 后前 2 分钟内常出现频发室性早搏及心电图电轴改变，但几乎总会在 2 分钟时转为稳定的窦性心动过速。
- 记录复苏总时间及肾上腺素使用剂量。ROSC 后 10 分钟内每分钟记录一次体温。
- 当自主呼吸开始时（通常在 ROSC 后 12–15 分钟内），可移除心电图导联。
- 当自主呼吸频率 >60 次/分钟时，拔除气管插管。
- 将小鼠置于术后恢复笼内，放置在设定为 37°C 的温控表面上，持续 2 小时，确保其可自由获取食物和饮水。待小鼠完全从麻醉中恢复并恢复活动能力后，可将其转移至标准的术后饲养环境中。
3. 放血/灌注固定与肾脏采集
- CA/CPR 后 24 小时，使用 3-4% 异氟烷诱导麻醉，并将动物仰卧位固定在通风橱内的手术台面上，该通风橱适用于甲醛操作。
- 通过逐步增加麻醉蒸气浓度至 5% 加深麻醉，确保小鼠已深度麻醉，表现为自主呼吸停止。
- 行双侧开胸术，并通过标准技术经心脏左心室心尖穿刺放血处死小鼠。
- 通过同一针头缓慢输注 0.9% 生理盐水。为加快灌注/放血速度，可用剪刀剪开右心耳。行剖腹术并观察肾脏；当肾脏变苍白时，可将生理盐水更换为 4% 多聚甲醛进行固定。随后将肾脏包埋于石蜡中，并用 Fluoro-jade B 染色以定量分析肾小管上皮细胞坏死。
4. 典型结果：
诱导心脏骤停（CA）后，平均动脉压（MAP）和肾区血流（RRBCF）迅速下降至接近零水平，并在复苏开始前保持稳定状态（图 1）。CA/心肺复苏（CPR）24小时后，肾功能血清指标（血尿素氮，BUN 和肌酐）显著高于假手术动物。AST/ALT 也明显升高，表明机体存在严重的全身性缺血（图 2）。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是肾缺血损伤的敏感指标，在 CA/CPR 后 24 小时显著上调（图 3）。最后，显微照片显示缺血性肾损伤典型的片状髓质坏死，苏木精-伊红染色可见肾小管上皮变薄及管腔充填（图 4，图版 a）；氟代玉染色（fluoro-jade B）显示髓质肾小管上皮细胞出现广泛性细胞死亡（图 4，图版 b）。
图1. 心脏骤停导致灌注压立即丧失，此处以股动脉测得的平均动脉压（MAP）表示，结果在整个心脏骤停期间（阴影区域）区域肾皮质血流量（RRCBF）几乎完全停止。通过胸外按压和肾上腺素进行复苏后，MAP 恢复至正常水平，RRCBF 在复苏后阶段逐渐回升。经许可转载自14。
图2. 手术后24小时，与接受假手术处理的动物相比，经历心脏骤停/心肺复苏（CA/CPR）的动物血液中尿素氮（BUN）、血清肌酐水平以及肾小管细胞死亡程度均显著升高。CA/CPR可引起全身性缺血性损伤，本研究中表现为CA/CPR小鼠的肝功能酶——丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平较假手术动物显著大幅升高。
图 3. 采用针对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）的多克隆抗体进行 Western blot 分析，NGAL 是肾缺血损伤的敏感指标。在 4 只动物（上图中标记为 a、b、c 和 d）中，于心搏骤停/心肺复苏（CA/CPR）前（“pre”）及 CA/CPR 后 24 小时（“24h”）立即采集尿液样本。NGAL 在小鼠 CA/CPR 后的尿液中显著上调。经许可重印自14。
图4. A) 心搏骤停/心肺复苏（CA/CPR）后24小时肾组织短轴门部切片的苏木精-伊红染色。可见髓质及皮髓交界处肾小管呈斑片状但明确的损伤，并伴有小管堵塞。箭头指向皮髓交界处肿胀、核固缩的受损小管。B) 同一动物同一区域在CA/CPR后24小时的Fluoro-Jade B染色。Fluoro-Jade B将坏死细胞染成亮绿色，显示皮髓交界处肾小管呈斑片状坏死。箭头指示在皮髓交界处被强烈染色的受损小管。这些发现与发生急性肾损伤（AKI）人类患者的肾活检结果高度相似，而不同于其他AKI动物模型所产生的结果。
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讨论
小鼠常温心脏骤停与心肺复苏模型为评估最常见临床急性肾损伤（AKI）病因——全身性低灌注——的病理生理学和形态学特征提供了多种研究途径。该模型得益于实验室小鼠遗传操作技术的广泛应用，以及其已被充分阐明和明确的解剖学与生理学特性，有助于开展假设验证研究。
如文中所述，在经验丰富的操作者手中，存活率可达80%。尽管手术准备和心脏骤停后的护理较为简单，但对心脏骤停小鼠的实际复苏是一项具有挑战性的外科技术，需要大量练习。根据我们的经验，一名缺乏经验的外科医生在对约前30至50只动物进行复苏尝试后，复苏成功才会逐渐成为常态，而实现稳定一致的损伤建模与复苏则需要进一步训练。特别是，在学习该技术的初期阶段（即前20只动物），获得有意义的存活几乎不可能，任何复苏后存活的动物均应在复苏后立即实施安乐死，以避免不必要的痛苦。在初步训练之后，当动物在复苏后数分钟内表现出强有力的心脏功能恢复时，可继续让其存活至自主循环恢复（ROSC）后15分钟。在此时间点已表现出强烈自主呼吸努力的动物，在适当护理条件下很可能存活24小时。这一训练阶段应在IACUC（实验动物照护与使用委员会）方案中明确说明。其中最难掌握的技...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钾 | Abbott Laboratories | 06653-5 | |
| 异氟烷 | Abbott Laboratories | 05260-05 (及其他) | |
| 盐酸肾上腺素 | 多家供应商 | 多种 | |
| Digi-Sense 温度控制器 | Cole-Parmer | EW-89000-00 | |
| Angiocath 静脉导管 | VWR international | 381134 | |
| Frova 角度气道导入器 | Cook | G27282 | |
| MicroVent 小鼠呼吸机 | Harvard Apparatus | 733591 |
参考文献
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