诱导多能干细胞向神经前体细胞的分化

摘要

来源：Phillips, A. W.，等。利用生理相关检测方法开发源自HiPSC的无血清拟胚体以研究三维干细胞培养。J. Vis. Exp. (2017)。

该视频演示了一种将人诱导性多能干细胞（hiPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs）的技术。首先，将hiPSCs培养在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。随后，将细胞解离并转移至经生物聚合物包被的培养板，使MEFs贴壁，从而与hiPSCs分离。悬浮的hiPSCs被转移至V型底培养板中，并通过离心形成细胞聚集体。最后，加入分化培养基，诱导聚集体内的hiPSCs分化为NPCs。

方案

1. 神经前体细胞的制备

1. 在添加小分子的 hiPSC 培养基中，将来源于成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）的 hiPSCs 维持于 6 孔板中，培养基底层为 γ 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）层。
   注意： 日常维护是对先前报道方法的改良版本。
   1. 将 6 × 10⁵ 个 MEF 细胞接种至 6 孔组织培养板的每孔中，每孔加入 300 μL 推荐培养基（按照制造商说明书操作）。
   2. 48 小时后，将 MEF 培养基更换为每孔 300 μL 的 hiPSC 培养基，孵育 1 小时后再接种 hiPSCs。
   3. 在 37 °C 水浴中快速解冻 hiPSCs，并缓慢逐滴加入 1 mL hiPSC 培养基。将细胞与培养基转移至 15 mL 圆底离心管中，补加培养基至总体积 5 mL。在 129 × g 条件下离心 4 分钟，吸除上清液，轻轻将细胞沉淀重悬于含 Rho 相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（1:1,000 浓度）的 1 mL hiPSC 培养基中。
   4. 将细胞悬液（通常以 300,000 个细胞/孔的密度接种）接种至 MEF 细胞层上，于 37 °C、5% CO₂、95% 湿度条件下培养。
   5. 使用光学显微镜密切观察 iPSC 培养状态。48 小时后，移除边缘不规则、呈囊状样生长或在光学显微镜下呈黄褐色的培养物，以减少自发分化。
      注意： 接种后 7–10 天，hiPSC 克隆应开始形成。克隆应呈圆形，边界清晰，细胞密度均匀，无松散排列或不均一的细胞。
   6. 手动挑选圆形 hiPSC 克隆，以清除自发分化的细胞。通过将克隆转移至新的 MEF 层进行扩增。当培养物接近汇合时，每 7 天按 1:3 比例传代一次，并进行冻存。
2. 扩增并冻存细胞（作为备份）后，将 hiPSC 克隆在培养板中继续培养，直至达到 50–75% 汇合度。
3. 接种后第 7 天，采用温和的酶消化法（加入 300 μL 酶溶液消化 5–10 分钟）并轻柔吹打（使用 1,000 µL 移液器吹打 2–4 次），收集并制备用于神经前体细胞分化的 hiPSCs。
4. 将细胞悬液在 129 × g 条件下离心 4 分钟，吸除上清液，将沉淀轻轻重悬于 5 mL 人 hiPSC 培养基中。将细胞悬液转移至经 0.1% 明胶包被的 5 cm 细胞培养皿中，于 37 °C 孵育 1 小时，以去除 MEF 细胞并最大化获得 hiPSCs。将上清液（含非贴壁细胞）转移至另一经明胶包被的 5 cm 培养皿中。
5. 使用移液管将非贴壁细胞转移至 15 mL 离心管中。用 3 mL 培养基轻轻冲洗培养皿，并将冲洗液加入 15 mL 离心管中。
6. 将细胞悬液在 129 × g 条件下离心 4 分钟，吸除上清液，轻轻将沉淀重悬于培养基中。使用自动细胞计数仪测定细胞数量。以每孔 9,000 个细胞的密度接种至 96 孔低吸附 V 型底板中。
7. 将培养板在 163 × g 条件下离心 3 分钟。于 37 °C、95% 湿度、5% CO₂ 条件下培养。使用移液器每隔一天更换 50% 培养基，即吸除一半培养基，补充等量新鲜的化学成分明确的分化培养基 1（DM1；图 1；材料表），持续 14 天。

结果

图1：制备SFEBs早期步骤的示意图。 诱导多能干细胞（iPSCs）经酶解法解离后，接种于96孔板中，并在163 × g条件下离心3分钟，以促进细胞快速聚集成团。体外培养14天（DIV）后，可通过宽口移液管将细胞聚集体从96孔板转移至含有细胞培养插件的6孔板中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SFEB 神经元分化 细胞培养 培养基、试剂、组分
STEMdiff 神经诱导培养基（hiPSC 培养基）	STEMCELL Technologies	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM 培养基（MEF 培养基）	GlobalStem	GSM-2001
DM1 培养基组分
D-MEM/F-12 (1X)，含 Glutamax 液体，1:1	Invitrogen	10565018	385ml
无血清替代物（Knockout Serum Replacement）	Invitrogen	10828028	20% 100ml
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM 非必需氨基酸溶液 10 mM (100X)，液体	Invitrogen	11140050	5ml
2-巯基乙醇（1,000X），液体	Invitrogen	21985023	900ul
小分子化合物
Y27632 (ROCKi)	Stemgent	04-0012-10	10uM
组分/材料
小鼠胚胎成纤维细胞	GlobalStem	GSC-6301G
96 孔 V 型底带盖板	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase 细胞解离试剂	ThermoFisher	A1110501
6 孔平底板	Falcon	353046