无血清胚胎体的建立与维持

摘要

来源：Phillips, A. W.，等。利用生理相关性检测方法开发源自HiPSC的无血清拟胚体以研究三维干细胞培养。J. Vis. Exp. (2017)。

该视频介绍了使用不同无血清分化培养基（DM）从神经前体细胞培养无血清拟胚体（SFEBs）的操作步骤。DM-2 有助于神经元的成熟和有序排列，从而形成 SFEBs，而 DM-3 则用于后续的生长维持。

方案

1. 无血清拟胚体（SFEB）诱导（图1）

1. 将40 µm细胞培养小室放入6孔板中，并加入1 mL分化培养基1（DM1）（材料表至少在加入聚集体前1小时。
2. 使用200 µL宽口枪头将含有20 µL培养基的神经前体细胞团转移至40 µm细胞培养插件中，并将培养基更换为DM2（材料表）。
   注意： 细胞培养小室是一种特殊设计的插入式装置，可置于孔板底部上方一定位置，由聚四氟乙烯膜固定于塑料支架上构成。该膜具有良好的生物相容性，能够有效支持营养物质和氧气向置于其上的SFEBs（胚状体）输送。此类装置常与来自小鼠或大鼠的海马组织切片共培养体系联合使用。
   1. 将4-6个细胞聚集体转移至一个细胞培养插件中，聚集体之间需留出足够空间。使用细尖移液器吸头（如200 μL吸头）尽可能吸除多余溶液。
      ​注意： 短暂扰动SFEB是可接受的，因为当溶液从SFEB周围移除时，它们会在细胞培养插件上发生移动。
   2. 在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下，用1 mL DM2培养基培养细胞。每隔一天用移液器更换75%的培养基，即移除四分之三的旧培养基，并加入四分之三的新鲜培养基。例如，移除750 μL培养基，加入750 μL新鲜培养基。
3. 培养14天后，更换为DM3培养基（材料表每隔一天更换75%的培养基，持续再培养16天。
4. 为使 SFEBs 在细胞培养插入物上维持超过 30 天，分别在第 60、90 和 120 天时每隔一天更换一次培养基。
   注意： SFEBs 的直径将生长至约 1,000 μm，厚度通常为 100–150 μm。
5. 使用200 µL宽口枪头轻轻吹打培养基，使SFEBs从插入物上脱离。转移SFEBs时，用宽口枪头轻柔吸取胚体至枪头中。将SFEBs吸入枪头后，轻柔转移至12孔板中，并每孔加入300 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。

结果

图1： SFEB生长与扩增过程中培养基更换和各阶段的时间线。

将SFEBs转移至插入式培养皿后，在体外培养第14天和第28天进行两次培养基更换。通常在体外培养第30、60和90天收获用于实验。上方插图显示了该过程中的不同阶段。比例尺 = 1,000 μm（最左侧）；1,000 μm（DIV 20）；600 μm（DIV 30）；300 μm（单个SFEB）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SFEB神经元分化细胞培养基、试剂及组分
STEMdiff神经诱导培养基（hiPSC培养基）	STEMCELL Technologies	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM培养基（MEF培养基）	GlobalStem	GSM-2001
DM1培养基组分
D-MEM/F-12 (1X)，含Glutamax液体，1:1	Invitrogen	10565018	385ml
Knockout血清替代物	Invitrogen	10828028	20% 100ml
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
MEM非必需氨基酸溶液 10 mM (100X)，液体	Invitrogen	11140050	5ml
2-巯基乙醇（1,000X），液体	Invitrogen	21985023	900ul
DM2培养基组分
D-MEM/F-12 (1X)，含Glutamax液体，1:1	Invitrogen	10565018	500ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Invitrogen	15140122	5ml
N-2补充剂（100X），液体	Invitrogen	17502048	10ml
DM3培养基组分
NEUROBASAL培养基（1X），液体	Invitrogen	21103049	500ml
B-27补充剂（不含维生素A，50X），液体	Invitrogen	12587010	10ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Invitrogen	15140122	5ml
组分/材料
	Millicell	PICM0RG50
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	10010023	500 mL