在多电极阵列上构建图案化神经元环路

摘要

来源：Kanner, S.，等。由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞铺板与培养。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了在图案化多电极阵列（MEA）上培养神经元细胞以构建模块化神经元网络的过程。该方法可用于研究神经信号传递和细胞间相互作用。

方案

1. 多电极阵列（MEA）制备

1. 按以下顺序清洗MEA（材料表）：
   1. 在自来水下冲洗，并在浓缩酶性洗涤剂中进行3次超声处理。
   2. 在蒸馏水中进行3次超声处理。
   3. 用蒸馏水（在通风橱中，使用1,000 µl枪头）冲洗3次，并置于紫外光（UV）下照射30分钟。
2. 支撑网络制备：
   1. 制备设计好的支撑网络模具。
      1. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒入12孔板（直径22 mm）中。
      2. 当PDMS固化后，取出模具，并使用手术刀在中央切割出一个孔，形成环形结构。
      3. 将设计好的支撑网络模具放置于MEA中心（图1A），并在其余表面覆盖多聚-D-赖氨酸（PDL），室温（RT）孵育2小时。
   2. 使用移液器去除PDL，并用蒸馏水冲洗。
   3. 移除模具并使其自然干燥（图1A）。
3. 以如下方式将模板与MEA对齐：
   1. 将模板放置在指定的显微操作器上。使用倒置显微镜精确对齐图案结构与电极，并降低模板直至其接触MEA表面（图1B）。
      注意：与清洁良好的MEA接触时，PDMS与MEA本身之间会产生较强的粘附力。
   2. 抬起显微操作器，如有必要，使用镊子在PDMS上方施加轻微压力，以防止其从MEA上脱落。
   3. 轻轻按压模板使其紧贴MEA表面，并使用显微镜确认其牢固附着且对齐良好（图1C-D）。
4. 将MEA放入真空室中15分钟；在模板上滴加1 ml PDL溶液。
5. 将样品再次放入真空室中处理2次，每次20分钟。随后在培养箱中过夜干燥PDL。
6. 铺板前，从MEA上移除PDMS模板，并用无菌水清洗。置于紫外光下照射7分钟。

2. 铺板

1. 使用血细胞计数板计算铺板所需的细胞数量
   1. 确保计数室（血细胞计数板）清洁，并将盖玻片盖在上面（可用酒精清洁）。
   2. 将 10 µl 细胞悬液加入 190 µl 铺板培养基中稀释（稀释比例为 1:20）。
   3. 将 10 µl 稀释后的细胞悬液加至计数室边缘，缓慢吹打，使液体自然充满计数室。
   4. 使用倒置显微镜观察血细胞计数板的网格区域，通过直接计数确定计数室内的细胞数量（健康细胞应呈圆形）。仅计数大方格内部的细胞，不包括压线的细胞。
   5. 计算细胞浓度：
      总细胞数/1000 µl = 实际计数细胞总数 × 稀释倍数 × 10⁴（血细胞计数板的计数区域面积）。
      注意： 例如，若稀释倍数为 20，计数得到的总细胞数为 100：
      100 × 20 × 10⁴ = 0.1 × 10⁷ 个细胞/1000 µl，或 1 × 10⁶ 个细胞/100 µl。若需铺板 0.75 × 10⁶ 个细胞，则取 75 µl 细胞悬液即可。
2. 根据每个微电极阵列（MEA）或培养皿所需的细胞数量，取相应细胞悬液，轻轻吹打重悬以防止细胞聚集，并将细胞悬液滴加至图案化区域中央（如需要，可用培养基进一步稀释）。对于 MEA，中央滴加 100 µl；对于盖玻片，中央滴加 1000 µl。
3. 将铺好细胞的培养板在 37 °C 下孵育 40 分钟，随后向每个 MEA 加入铺板培养基至总体积 1 ml，每个盖玻片加入至 2 ml。
4. 维持在 37 °C 培养环境，每隔 4 天更换一次新鲜生长培养基，培养基中需添加 0.5 Pen-Strep、2% B-27 和 0.75% GlutaMax。
5. 自第 6–7 天体外培养（DIV）起，当观察到各岛状结构之间出现连接后，使用含 10 µl/ml FUDR 的培养基（将 25 mg 脱氧尿苷和 62.5 mg 尿苷溶于 12.5 ml MEM（Eagle 最低必需培养基））或其他抗有丝分裂试剂稀释培养基，以抑制胶质细胞过度生长。

结果

图 1. 在微电极阵列（MEA）上沉积 PDMS 结构。（A） 呈环形的 PDMS 模具（红箭头标记）安装在 MEA 上。该模具用于包被神经元网络的支撑区域，该区域位于培养区域的外围（由安装在 MEA 上的环形结构限定，绿箭头标记）。（B） 使用显微操作器将 PDMS 套膜对准至 MEA 上。（C） 对准后已沉积在 MEA 上的 PDMS 套膜。（D） 使用 10 倍物镜拍摄的 MEA 上 PDMS 套膜图像（电极间距为 500 µm）。可观察到套膜上与电极位置对应的孔洞。促进细胞黏附的黏附层将仅沉积在开放区域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Nalgene 真空室	Thermo	5305-0609
聚-D-赖氨酸 PDL	Sigma	P7886
12 孔细胞培养板	Sigma	CLS3336
5-氟-2'-脱氧尿苷	Sigma	F0503
MEA1060-Inv-BC	Multi Channel Systems
TC02	Multi Channel Systems
青霉素-链霉素（Pen Strep）	Biological Industries Beit Haemek	03-033-1c
B-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	35050-038
MEM 最低必需培养基-伊格尔（Minimum Essential Medium-Eagle）	Biological Industries Beit Haemek	01-025-1B
微电极阵列 4Q	Multi Channel Systems	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	清洗手册：http://www.multichannelsystems.com