将基因编辑的人诱导多能干细胞分化为功能性运动神经元

摘要

来源：Garone, M. G.，等。利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了将人iPSCs分化为运动神经元的过程。其原理是利用经过基因改造、可表达特定转录因子的iPSCs。当在含有多西环素的培养基中培养时，该抗生素会诱导转录因子的表达，从而促进iPSCs向运动神经元前体细胞分化。最终，将这些前体细胞在神经元培养基中培养，以获得成熟且具有功能的运动神经元。

方案

1. 人类iPSC的维持

1. 基质包被培养板的制备
   1. 将一管5 mL的基质（见材料表）在4 °C下过夜解冻。原始基质库存浓度各不相同，需根据数据表上标明的稀释倍数进行分装，且分装方案针对每一批次具体确定。必须保持管子和离心管处于冰上低温状态，以防止基质提前凝胶化。在预冷的冻存管中于冰上分装基质。未使用的分装样品在-20 °C下冷冻保存。
   2. 取一份分装样品置于冰上约2小时以解冻。
   3. 在50 mL锥形管中，用20 mL冷的DMEM/F12稀释该份基质。
   4. 充分混匀后，将1 mL稀释后的基质加入35 mm培养皿中（其他规格培养皿按表面积等比例添加）。
   5. 将含有稀释基质的培养皿在室温下放置1小时，以完成包被。
      注意：用封口膜密封的培养皿可在4 °C下保存最多2周。
2. 温和细胞解离试剂储备液（20 mL）及1x工作液分装的制备（见材料表）。
   1. 将粉末溶于PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）中，配制成10 mg/mL的溶液。
   2. 使用0.22 μm滤膜过滤除菌。
   3. 分装成20份（每份1 mL），于-20 °C保存。
   4. 使用前，取一份分装样品用PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）稀释至1 mg/mL（即1x工作液）。
      注意：1x工作液可在4 °C下保存2周。
3. 人iPSC的传代。
   1. 开始前准备：若基质包被培养板储存在4 °C，需将其在37 °C培养箱中预热20–30分钟。将所需量的人iPSC培养基（见材料表）在室温下预热。同时预热DMEM/F12。
   2. 吸除培养基。
   3. 用PBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）冲洗iPSC。
   4. 加入1x温和解离溶液（35 mm培养皿加0.5 mL）。在37 °C孵育，直至克隆边缘开始从培养皿脱离，通常为3–5分钟。
   5. 吸除温和解离溶液，注意避免将iPSC克隆完全脱离。
   6. 用DMEM/F12（35 mm培养皿加2 mL）洗涤细胞后吸除，注意避免细胞脱落。重复此步骤一次。
   7. 加入人iPSC培养基（35 mm培养皿加1 mL）。
   8. 用细胞刮轻轻刮下克隆，并转移至15 mL离心管中。
   9. 用P1000移液器轻轻吹打3–4次，使细胞团块分散。
   10. 吸除基质包被培养板中的上清液。
   11. 将细胞以适当体积的人iPSC培养基进行接种。传代比例因细胞系而异，通常为1:4–1:8。每日更换培养基。

2. 生成可诱导的 NIL 和 NIP iPSC 细胞系

1. 细胞转染
   1. 用 PBS（无 Ca²⁺/Mg²⁺）清洗细胞。
   2. 加入细胞解离试剂（见材料表）（35 mm 培养皿加 0.35 mL），在 37 °C 下孵育至细胞分散成单细胞状态（5–10 分钟）。
   3. 用 P1000 移液器轻轻吹打 3–4 次，完成细胞的完全解离。
   4. 将细胞收集至 15 mL 离心管中，加入 PBS（无 Ca²⁺/Mg²⁺）至 10 mL，计数细胞。
   5. 离心收集 10⁶ 个细胞，重悬于 100 μl 转染缓冲液 R 中（包含在细胞电穿孔试剂盒中；见材料表）。
   6. 加入用于转染的质粒 DNA：4.5 μg 转座载体（epB-Bsd-TT-NIL 或 epB-Bsd-TT-NIP12）和 0.5 μg piggyBac 转座酶质粒。
   7. 使用细胞电穿孔系统（见材料表）进行转染，按照制造商说明书及先前描述的参数操作：电压 1,200 V，脉冲宽度 30 ms，单次脉冲。将细胞接种于添加了 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂，见材料表）的人 iPSC 培养基中，培养于 6 mm 基质包被的培养皿中。
2. 抗生素筛选
   1. 转染后两天，向培养基中加入 5 μg/mL 嘌呤霉素（blasticidin）。
   2. 大多数未转染的细胞将在嘌呤霉素筛选 48 小时内死亡。持续用嘌呤霉素处理细胞至少 7–10 天，以淘汰未将转基因整合入基因组的细胞。
   3. 将稳定转染的细胞作为混合群体维持培养（群体中细胞含有不同数量的转基因及不同的整合位点），或分离单克隆。
   4. 准备另一培养皿，通过 RT-PCR 检测在 1 μg/mL 多西环素诱导下转基因的表达效率，使用针对 Ngn2 的特异性引物（正向：TATGCACCTCACCTCCCCATAG；反向：GAAGGGAGGAGGGCTCGACT）。
   5. 在此阶段，将新建立的 NIL-iPSC 和 NIP-iPSC 细胞系使用人 iPSC 冻存液（见材料表）冻存备用。

3. 运动神经元分化

1. 使用细胞解离试剂解离细胞，方法如前所述（步骤 2.1.1–2.1.3）。将解离后的细胞收集至 15 mL 离心管中，并用 5 倍体积的 DMEM/F12 稀释。离心收集细胞，重悬于添加了 10 μM ROCK 抑制剂的人类诱导多能干细胞培养基中。计数细胞，并以 62,500 个细胞/cm² 的密度接种于基质包被的培养皿中。
2. 次日，更换为 DMEM/F12 培养基，其中添加 1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× 非必需氨基酸（NEAA）细胞培养添加剂和 0.5× 青霉素/链霉素，并含 1 μg/mL 多西环素。此时间点记为分化第 0 天。在第 1 天更换培养基和多西环素。
3. 第 2 天，更换为 Neurobasal/B27 培养基（Neurobasal 培养基添加 1× B27、1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× NEAA 和 0.5× 青霉素/链霉素），并含有 5 μM DAPT、4 μM SU5402 和 1 μg/mL 多西环素（见材料表）。每天更换培养基和多西环素，直至第 5 天。
4. 第 5 天：使用细胞解离试剂进行细胞解离（见材料表）。
   1. 用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 冲洗细胞。
   2. 加入细胞解离试剂（35 mm 培养皿加 0.35 mL），于 37 °C 孵育，直至整个细胞单层从培养皿脱离。
      注意：孵育过程中不会形成单个细胞悬液。
   3. 加入 1 mL DMEM/F12，将细胞收集至 15 mL 离心管中。
   4. 用 P1000 移液器轻柔吹打 10–15 次，完成细胞的进一步解离。
   5. 加入 4 mL DMEM/F12，计数细胞。
   6. 此阶段可根据制造商说明，将运动神经元前体细胞用细胞冻存液（见材料表）进行冻存。
   7. 离心收集细胞，重悬于神经元培养基（Neurobasal/B27 培养基添加 20 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF 和 200 ng/mL L-抗坏血酸，见材料表）中，并补充 10 μM ROCK 抑制剂。
   8. 以 100,000 个细胞/cm² 的密度将细胞接种于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被或替代性基质包被的培养表面。如需进行免疫染色分析，建议使用带有聚合物盖玻片的 μ-Slide 塑料培养载具（见材料表）。
5. 第 6 天，更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜神经元培养基。此后每隔 3 天更换一半培养基。更换培养基时操作必须轻柔，以防细胞从培养表面脱落。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	细胞解离试剂
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	用于神经元细胞维持的无血清添加剂
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	细胞冻存培养基，此处用于运动神经元前体细胞
BDNF	PreproTech	450-02	脑源性神经营养因子
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	抑制原核和真核生物蛋白质合成的核苷类抗生素
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	牛血清白蛋白。在免疫染色实验中用作封闭剂，防止抗体非特异性结合
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	用于电生理溶液的化学试剂
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	用于电生理溶液的化学试剂
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	人诱导性多能干细胞（iPSC）冻存培养基
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	用于电生理溶液的化学试剂
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	γ-分泌酶抑制剂
Dispase	Gibco	17105-041	用于温和解离人诱导性多能干细胞（iPSC）的试剂
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	细胞培养基础培养基
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	用于诱导epB-Bsd-TT-NIL和epB-Bsd-TT-NIP载体中外源基因的表达
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	商业化人诱导性多能干细胞系
GDNF	PreproTech	450-10	胶质细胞源性神经营养因子
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	商业化人诱导性多能干细胞系
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	一种比L-谷氨酰胺更稳定的替代物，可改善细胞健康状态
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	用于电生理溶液的化学试剂
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	在细胞培养中用作抗氧化剂
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	促进神经细胞在体外的贴附和生长
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	非必需氨基酸。作为细胞培养基的补充成分，用于提高细胞生长和存活率
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	细胞电穿孔试剂盒
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	细胞电穿孔系统
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	专为神经元细胞群体的长期维持和成熟设计的基础培养基，无需星形胶质细胞饲养层
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	人诱导性多能干细胞（iPSC）培养基
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	含钙、含镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline）
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	不含钙、不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffer Saline）
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	青霉素/链霉素溶液，用于防止细胞培养过程中细菌污染
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	促进神经细胞在体外的贴附和生长
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）的选择性抑制剂
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚。用于免疫染色实验中的细胞通透化处理
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	细胞通透性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）选择性抑制剂，可提高诱导性多能干细胞（iPSC）的存活率
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	用于固定细胞的高端显微分析载具