将工程化人诱导的多能干细胞分化为功能性运动神经元

摘要

来源:Garone， M. G.， et al.使用 PiggyBac 载体将人诱导多能干细胞 （iPSC） 转化为功能性脊髓和颅运动神经元。J. Vis. Exp.（2019 年）。

该视频展示了将人类 iPSC 分化为运动神经元的过程。基本原理涉及利用经过基因修饰以表达特定转录因子的 iPSC。当在含有多西环素的培养基中培养时，这种抗生素会触发转录因子的表达，从而促进 iPSC 分化为运动神经元祖细胞。最终，祖细胞在神经元培养基中培养，以产生成熟且功能正常的运动神经元。

方案

1. 人类 iPSC 的维持

1. 基质涂层板的制备
   1. 在 4 °C 下解冻一瓶 5 mL 基质（参见材料表）过夜。原始基质储备液具有不同的储备液浓度，等分试样根据数据表上指示的稀释因子制成，并且特定于各个批次。保持样品瓶和试管冰冷以防止基质过早胶凝至关重要。将基质分装成等分试样，放入冰上预冷的冻存管中。将未使用的等分试样在 -20 °C 下冷冻。
   2. 将一份等分试样放在冰上约 2 小时以解冻。
   3. 在 50 mL 锥形管中用 20 mL 冷 DMEM/F12 稀释基质的等分试样。
   4. 充分混合，将 1 mL 稀释的基质分配到 35 mm 培养皿中（与其他培养皿的单位表面积等量相同）。
   5. 将含有稀释基质的培养皿在室温下放置 1 小时以允许涂层。
      注意:用封口膜密封的培养皿可在 4 °C 下储存长达 2 周。
2. 制备储备液 （20 mL） 和 1x 工作等分试样的温和细胞解离试剂（参见材料表）。
   1. 在 PBS 中将粉末溶解至 10 mg/mL（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）
   2. 通过 0.22 μm 滤膜过滤灭菌。
   3. 准备 20 个等分试样（每个 1 mL）并将它们储存在 -20 °C。
   4. 使用前，在 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）中将一份等分试样稀释至 1 mg/mL（1 x 工作等分试样><）。 注意:1x 工作等分试样可在 4 °C 下储存 2 周。
3. 传代人类 iPSC。
   1. 开始前:如果在 4 °C 下储存，则在 37 °C 的培养箱中预热基质包被的板 20-30 分钟。在室温下预热所需的人 iPSC 培养基量（参见材料表）。预热 DMEM/F12。
   2. 吸出培养基。
   3. 用 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）冲洗 iPSC。
   4. 加入 1x 温和的解离溶液（35 mm 培养皿为 0.5 mL）。在 37 °C 下孵育，直到菌落的边缘开始从板中分离，通常需要 3-5 分钟。
   5. 吸出温和的解离溶液，注意不要分离 iPSC 集落。
   6. 用 DMEM/F12（35 mm 培养皿为 2 mL）洗涤细胞并吸出，注意不要分离细胞。再重复一次此步骤。
   7. 添加人 iPSC 培养基（35 mm 培养皿为 1 mL）。
   8. 用细胞提升器轻轻分离菌落，并将其转移到 15 mL 试管中。
   9. 用 P1000 移液器上下吹打 3-4 次，轻轻打破细胞团块。
   10. 从基质包被的板中吸出上清液。
   11. 将细胞接种在适当培养体积的人 iPSC 培养基中。分光比可能因生产线而异，约为 1:4-1:8。每天更换培养基。

2. NIL 和 NIP 诱导型 iPSC 细胞系的生成

1. 细胞转染
   1. 用 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）冲洗细胞。
   2. 加入细胞解离试剂（参见材料表）（35 mm 培养皿为 0.35 mL）并在 37 °C 下孵育直至分离单个细胞（5-10 分钟）。
   3. 用 P1000 移液器上下移液 3-4 次，轻轻完成细胞分离。
   4. 收集在 15 mL 试管中，并将 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）添加至 10 mL。计数细胞。
   5. 沉淀 10⁶ 个细胞并重悬于 100 μl 缓冲液 R（包含在细胞电穿孔试剂盒中;参见材料表）。
   6. 添加质粒 DNA 进行转染:4.5 μg 转座因子载体（epB-Bsd-TT-NIL 或 epB-Bsd-TT-NIP12）和 0.5 μg piggyBac 转座酶质粒。
   7. 根据制造商的说明和之前描述的以下参数，使用细胞电穿孔系统（参见材料表）进行转染:1,200 V 电压，30 ms 宽度，1 个脉冲。在 6 mm 基质包被的培养皿中，将细胞接种在补充有 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂，参见材料表）的人 iPSC 培养基中。
2. 抗生素选择
   1. 转染后 2 天，向培养基中加入 5 μg/mL 杀稻瘟菌素。
   2. 大多数未转染的细胞将在选择杀稻瘟菌素后 48 小时内死亡。将细胞保存在杀稻瘟菌素中至少 7-10 天，以反选择尚未将转基因整合到基因组中的细胞。
   3. 将稳定转染的细胞维持为混合细胞群，由具有不同转基因数量和不同整合位点的细胞组成，或分离单个克隆。
   4. 准备一个额外的培养皿，以检查通过 RT-PCR 诱导 1 μg/mL 多西环素后转基因的有效表达，并使用 Ngn2 的转基因特异性引物（转发:TATGCACCTCACCTCCCCATAG;反面:GAAGGGAGGAGGGCTCGACT）。
   5. 在此阶段，将新型 NIL 和 NIP-iPSC 系的原液冷冻在人 iPSC 的冷冻培养基中（参见材料表）。

3. 运动神经元分化

1. 如所述，用细胞解离试剂解离细胞（步骤 2.1.1.-2.1.3.）。将解离的细胞收集在 15 mL 试管中，并用 5 体积的 DMEM/F12 稀释。沉淀细胞并重悬于补充有 10 μM ROCK 抑制剂的人 iPSC 培养基中。在基质包被的培养皿上以 62,500 个细胞/cm² 的密度对细胞和种子进行计数。
2. 第二天，用 DMEM/F12 替换培养基，补充有 1x 稳定的 L-谷氨酰胺类似物、1x 非必需氨基酸 （NEAA） 细胞培养补充剂和 0.5x 青霉素/链霉素，含有 1 μg/mL 多西环素。这被认为是分化的第 0 天。第 1 天，刷新培养基和多西环素。
3. 第 2 天，将培养基更换为 Neurobasal/B27 培养基（补充有 1x B27、1x 稳定 L-谷氨酰胺类似物、1x NEAA 和 0.5x 青霉素/链霉素的 Neurobasal 培养基），含有 5 μM DAPT、4 μM SU5402 和 1 μg/mL 多西环素（参见材料表）。每天刷新培养基和多西环素，直到第 5 天。
4. 第 5 天:用细胞解离试剂解离细胞（参见材料表）。
   1. 用 PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）冲洗细胞。
   2. 加入细胞解离试剂（35 mm 培养皿为 0.35 mL）并在 37 °C 下孵育，直到整个细胞单层从培养皿中分离><。 请注意，在孵育过程中不会分离单个细胞。
   3. 加入 1 mL DMEM/F12 并将细胞收集在 15 mL 试管中。
   4. 用 P1000 移液器上下移液 10-15 次，轻轻完成细胞分离。
   5. 加入 4 mL DMEM/F12 并计数细胞。
   6. 在此阶段，根据制造商的说明，将运动神经元祖细胞冷冻在细胞冷冻培养基中（参见材料表）。
   7. 沉淀细胞并重悬于补充有 10 μM ROCK 抑制剂的神经元培养基（补充有 20 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF 和 200 ng/mL L-抗坏血酸的 Neurobasal/B27 培养基，参见材料表）中。
   8. 将细胞接种在聚鸟氨酸/层粘连蛋白上，或者以 100,000 个细胞/cm² 的密度接种在基质包被的支持物上。使用带有聚合物盖玻片的 μ-Slide 塑料支架（参见材料表）进行免疫染色分析。
5. 第 6 天，将培养基更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜神经元培养基。在接下来的几天里，每 3 天刷新一半的介质。必须非常小心地更换培养基，以防止从表面脱落。

材料