构建人角膜成纤维细胞与神经元的三维共培养模型

本文内容

摘要

本视频展示了一种建立人原代角膜成纤维细胞与分化神经元细胞三维共培养模型系统的技术。该共培养系统可用于研究基质与神经之间的相互作用。

方案

1. 人角膜成纤维细胞（HCFs）原代培养及三维结构构建

从先前在 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂中培养的组织块中分离并计数人包皮成纤维细胞（HCFs），以构建三维结构。
将约 1 × 10⁶ 个原代 HCFs 接种至带有 0.4-µm 孔径的聚碳酸酯膜插入式培养板的每个孔中，作为三维结构的基础，并在结构顶部加入 1.5 mL 新鲜的 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂培养基，同时在每个结构底部也加入 1.5 mL 相同的培养基。
细胞接种 24 小时后，使用 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗真菌剂培养基培养细胞，并通过在每个结构的顶部和底部各加入 1.5 mL 含 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的培养基进行刺激。
将培养物置于 37 °C、5 % CO₂ 的培养箱中培养 3 周，在整个实验期间每隔一天更换新鲜培养基。此过程中无需进一步传代。

2. 细胞分化与共培养

3 周后，在先前组装好的 3D 构建物顶部每孔接种 8 × 10³ 个 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞，构建物内含有 1.5 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。
1. 让 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞在角膜基质细胞顶部生长至少 24 小时，然后开始细胞分化。
通过在构建物顶部加入含 1% FBS 和 1.5 mL 10 µM 视黄酸的 EMEM 培养基刺激细胞，启动 SH-SY5Y 细胞分化。在构建物底部加入 1.5 mL 含 10% FBS、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。注意：视黄酸处理步骤应在避光条件下进行。
1. 在此分化培养基中继续培养细胞 5 天。
当细胞进入分化阶段时，将构建物顶部更换为 1.5 mL 无血清培养基，该培养基为在 EMEM 中添加 2 nM 脑源性神经营养因子（BDNF）和 1% 抗生素/抗真菌剂；同时在构建物底部加入 1.5 mL 含 10% FBS、1% 抗生素/抗真菌剂和 0.5 mM 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）的 EMEM 培养基。注意：BDNF 处理步骤也应在避光条件下进行。
再继续培养细胞 2 天，之后即可进行后续分析处理。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
杜氏磷酸盐缓冲液（1X）	Gibco by Life Technologies	14190-144
无菌镊子	Fischer Scientific	13-812-42	Fisherbrand 解剖用超细尖镊子
单刃剃须刀片	Personna	270100
无菌外科手术刀片 No.10	Feather Surgical Blade	2976#10
伊格尔最低必需培养基	ATCC	30-2003
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550	培养基配制需添加 10% 胎牛血清
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco by Life Technologies	15240-062	培养基配制需添加 1% 抗生素-抗真菌剂
0.05% 胰蛋白酶 EDTA（1X）	Gibco by Life Technologies	25300062
孔径为 0.4-μm 的聚碳酸酯膜插件	Corning Costar	3412
2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素 C）	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	实验应使用 0.5 mM 的浓度
SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
维甲酸	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	终浓度需为 10 μM
BDNF	Sigma-Aldrich	R2625-100MG	终浓度需为 2 nM
二甲基亚砜（DMSO）	VWR-Alfa Aesar	67-68-5	应使用超纯级无菌 DMSO
Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理 EasYFlask（T25）	Fisher Scientific	12-565-351
Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理 EasYFlask（T75）	Fisher Scientific	12-565-349

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