调节秀丽隐杆线虫产卵行为的单个神经元中的钙成像

摘要

来源:Ravi， B. et al.， 行为秀丽隐杆线虫中单个神经元的比率钙成像。J. Vis. Exp. （2018 年）。

该视频演示了一种使用遗传编码的荧光报告蛋白对行为秀丽隐杆线虫的单个神经元进行钙成像的技术。它概述了对蠕虫运动进行成像和测量神经元报告基因荧光比率以将细胞内钙水平与产卵过程中神经元活动和行为变化相关联所涉及的步骤。

方案

1. 菌株、培养基和动物的安装

1. 在 20 °C 下在接种有 OP50 大肠杆菌细菌食物的标准 60 毫米线虫生长培养基 （NGM） 琼脂平板上培养秀丽隐杆线虫蠕虫。
2. 为每个感兴趣的细胞特异性启动子准备两个质粒:一个驱动 GCaMP5 的表达以记录细胞内 Ca²⁺，第二个驱动 mCherry 的表达，以允许 GCaMP5 荧光变化的比率定量并简化对象查找和测量><。 注意:GCaMP5:mCherry 比率成像校正由焦点和动物运动变化引起的 GCaMP5 荧光波动，而不是细胞内 Ca²⁺ 的实际变化。
将
3. 表达 GCaMP5 和 mCherry 的质粒以及 pL15EK 可见拯救标记质粒注射到 LX1832 lite-1（ce314）、lin-15（n765ts） X 突变动物的性腺中，并从高拷贝转基因中回收表达 GCaMP5 和 mCherry 的非 Muv lin-15（+） 动物。使用 lite-1 突变背景来减少蓝光回避行为。
4. 将转基因整合到染色体上，以减少嵌合体并简化复合突变菌株的生成><。 注意:此处描述的 LX2004 菌株携带一个集成的高拷贝转基因，该转基因在 nlp-3 启动子的 HSN 中表达 GCaMP5 和 mCherry（参见材料表）。发现 nlp-3 启动子在晚期 L4 和成年动物的 HSN 中强烈表达，与测试的其他启动子（例如 tph-1、egl-6 和 unc-86）相比，不会导致 HSN 发育或产卵行为出现显着缺陷。该菌株和其他在腹侧脊髓 （VC） 运动神经元、外阴肌肉和 uv1 神经内分泌细胞中表达 GCaMP5 和 mCherry 的菌株可从 Caenorhabditis 遗传学中心获得，并且已经描述了它们的构建细节。
5. 将来自接种的 NGM 琼脂平板的 OP50 细菌食物涂在铂蠕虫镐的底部，并用它来转移 ~ 20 只晚期 L4 LX2004 动物，这些动物在 HSN 中表达 GCaMP5 和 mCherry 来自 nlp-3 启动子。确保发育中的外阴在立体显微镜下显示为一个被白色新月包围的透明黑点。将动物在 20 °C 下孵育 24-40 小时。
6. 孵育后，将 OP50 施用到拾取物上，并将 ~ 3 条蠕虫转移到未接种的 NGM 板中，留下少量食物供蠕虫在成像过程中食用。确保食物充足，因为细菌食物太少会促使蠕虫远离盘子的中心，而过多的食物会增加背景荧光并导致缺氧。
7. 使用扁平的圆形刮刀从携带蠕虫的板上切下 ~ 20 mm x 20 mm 的块，并将块面朝下转移到干净的 24 mm x 60 mm #1.5 盖玻片的中心（图 1）。从一侧开始应用，以防止气泡被困在盖玻片下并干扰成像。将 22 mm x 22 mm #1 盖玻片贴在块的顶部，以减少粘连和蒸发。

2. 硬件和检测设置

1. 将暂存的转基因蠕虫放在倒置显微镜的载物台上，该显微镜具有≥ 0.7 数值孔径平场复消色差 20 倍物镜、电动 XY 载物台，可通过纵杆、图像分割器和荧光滤光片控制，用于同时 GCaMP5 和 mCherry 激发和发射，用于荧光和红外明场成像的相机，以及可触发的发光二极管 （LED） 照明系统（图 2A）
   注意:80/20 分束器将 80% 的图像信号发送到荧光相机，将 20% 的图像信号发送到明场相机。也可以使用正置显微镜，但在这种情况下，NGM 块应放置在载玻片和大盖玻片之间。
   1. 使用双目目镜选择蠕虫进行成像。选择动物后，将红外滤光片滑入冷凝器上方的适当位置。
2. 晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 触发器
   1. 从荧光相机的三条 TTL 触发输出线中的每一条连接同轴电缆。将第一个输出连接到 LED 照明系统的 BNC 输入 #3。
   2. 将第二个输出连接到带有绿色和棕色线的 BNC"香蕉"适配器，从 8 针 GPIO 连接器分别连接到红外摄像机的 GPIO 输入 #3（引脚 4）和接地（引脚 5）。
   3. 将第三个输出连接到 BNC"香蕉"适配器，跳线连接到数字采集设备中的 #8 数字输入和接地（图 2B）。
3. 数字采集设备 （DAQ）
   1. 通过 USB 电缆将 DAQ 微控制器板（参见材料表）连接到 PC。使用标准 Firmata 协议更新固件（请参阅 材料表），并将 USB 端口配置为以 57600 波特率进行通信。
4. 发光二极管
   1. 运行 LED 控制器软件（参见材料表）。将触发模式从"连续"切换到"门控"，并为 470 和 590 nm LED 选择触发通道"3"。
   2. 打开并输入每个 LED 的 LED 功率（例如，将 470 nm LED 设置为 20%，将 590 nm LED 设置为 40%）。
5. 在 Bonsai 中运行串行阶段通信脚本"XY-stage-final" （请参阅 材料表） 。单击灰色的"CsvWriter"节点，然后选择一个文件夹以保存记录的 X 和 Y 阶段信息（图 3）。按下工具栏中的绿色箭头初始化 DAQ.
   注意:当荧光相机发送 TTL 信号时，该脚本将开始记录 X 和 Y 载物台位置。此脚本输出四列数据:帧编号、X 位置 （μm）、Y 位置 （μm） 和帧之间的间隔 （s）。
6. 在红外摄像机录制软件（参见材料表）中，在"自定义视频模式"下，选择"模式 1"（2 x 2 像素合并;1,024 x 1,024 像素）和"像素格式 Raw 8"。在"触发/频闪"下，将触发输入线 （GPIO） 设置为"3"，将极性设置为"高"，将"模式"设置为"14"。切换 'Enable' 以停止帧采集，直到接收到 TTL 触发信号。
   1. 保持该窗口打开，单击主摄像机视图工具栏上的红色"Record"按钮。选择要保存的图像序列的文件夹。选择 'Buffered' Recording 模式并以 JPEG 格式保存 'Images'。点击 "Start Recording" 初始化采集。
7. 荧光相机和图像分配器
   注意:必须同时收集 GCaMP5 和 mCherry 荧光通道，以确保正确配准用于比率定量。图像分流器允许在一个传感器上对 GCaMP5 和 mCherry 荧光进行双通道采集。
   1. 在图像采集软件的"捕获"选项卡中（参见材料表），将曝光时间设置为 10 毫秒，将像素合并设置为 4 倍，将图像深度设置为 16 位。选择一个 512 像素宽 x 256 像素高的居中摄像机子阵列。点击 'Show Output Trigger Options' 并将所有触发器设置为 'Positive.
      注意: 如果 TTL 触发为 10 ms 或更短，DAQ 偶尔会错过 TTL 触发。
   2. 确保将"触发器 1"和"触发器 2"设置为"曝光"，同时将"触发器 3"设置为"可编程"，"周期"为 25 毫秒。在"序列"选项卡下，选择"延时摄影"，"场延迟 1"为 50 毫秒，以 20 Hz 的速度收集图像。选择"保存到临时缓冲区"。
8. 三通道共聚焦成像期间的 PMT 增益和激光强度
   1. 设置 PMT 增益，使背景荧光处于略高于最小值（黑色水平）的水平。增加 561 nm（绿色）激光功率，直到在 mCherry 通道的突触前末端观察到单个饱和的 12 位或 16 位像素。
   2. 调整 488 nm（蓝色）激光强度，使 GCaMP5 荧光在背景上方的突触前末端可见。当荧光因强 Ca²⁺ 瞬变而增加时，此低设置可防止 GCaMP5 像素饱和。完全打开共聚焦针孔，以最大限度地捕获光线。

3. 比率式 Ca²⁺ 成像和行为记录

1. 在荧光采集软件的"序列"选项卡下，单击"开始"开始记录。用纵杆跟踪蠕虫，使感兴趣的细胞和突触保持聚焦并在视野 （FOV） 的中心。点击直方图窗口中的 'Stats' 按钮，显示每个通道的像素统计数据。
2. 调整 LED 功率以确保突触前末端的最大单像素 mCherry 荧光≥ 8,000 个计数（~ 4,000 个光电子），在背景上方提供 ~ 12 位动态范围（~ 100 个光电子）。在静息（低）Ca²⁺ 期间突触前末端的 GCaMP5 信号应在 ~ 2,500 计数左右 - 就在背景上方可见。
3. 记录，直到达到一个产卵活跃状态;通常，在野生型蠕虫中每 20-30 分钟发生一次。保存一个 10 分钟的子集（12,001 帧），在第一次产蛋事件（第 6,001 帧）之前和之后保存 6,000 帧。请务必保持蠕虫行为的明场图像子集和 XY 阶段位置的时间点，否则数据流的精确同步将丢失。
4. 使用 ImageJ 和 BioFormats 插件（参见材料表）将图像序列转换为图像细胞术标准 （.ics） 格式，以便将其导入 Ratiometric Quantitation 软件。

结果

图 1.秀丽隐杆线虫安装技术，用于产卵电路活动和行为的高分辨率成像。顶部，从侧面开始的最后一个安装。底部，通过大盖玻片的底部观察的最终安装。箭头表示 OP50 细菌食物、秀丽隐杆线虫蠕虫和卵，夹在 NGM 琼脂块和 24 mm x 60 mm 的大盖玻片之间。

图 2.在倒置落射荧光显微镜上进行宽场比率 Ca²⁺ 成像和行为记录。（A） 使用卤素灯通过 NGM 块发射的红外 （750-790 ...

材料