秀丽隐杆线虫卵子产出行为调控中单个神经元的钙成像

摘要

来源：Ravi, B. 等 行为秀丽隐杆线虫中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用基因编码的荧光报告蛋白对行为活动中的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）单个神经元进行钙成像的技术。该方法概述了成像线虫运动以及从神经元中测量报告蛋白荧光比值的步骤，以将细胞内钙水平与神经元活动及产卵过程中的行为变化相关联。

方案

1. 菌株、培养基与动物固定

1. 在接种了 OP50 大肠杆菌（E. coli）作为食物的标准 60 mm 线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，于 20 °C 培养 C. elegans 线虫。
2. 为每个感兴趣的细胞特异性启动子准备两种质粒：一种驱动 GCaMP5 表达以记录细胞内 Ca²⁺，另一种驱动 mCherry 表达，以便对 GCaMP5 荧光变化进行比率定量，并简化目标物的识别与测量。
   注意： GCaMP5 与 mCherry 的比率成像可校正因焦距变化和动物运动引起的 GCaMP5 荧光波动，而非细胞内 Ca²⁺ 的真实变化。
3. 将表达 GCaMP5 和 mCherry 的质粒连同 pL15EK 可见拯救标记质粒一起注射到 LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X 突变体动物的性腺中，并筛选出非黏连表型（non-Muv）且携带 lin-15(+) 的后代，这些后代通过高拷贝转基因表达 GCaMP5 和 mCherry。使用 lite-1 突变背景以减少蓝光回避行为。
4. 将转基因整合到染色体中，以减少嵌合现象并简化复合突变株的构建。
   注意： 本文所述 LX2004 品系携带一个高拷贝整合的转基因，该转基因在 HSN 神经元中由 nlp-3 启动子驱动表达 GCaMP5 和 mCherry（见材料表）。与其他测试的启动子（如 tph-1、egl-6 和 unc-86）相比，nlp-3 启动子在晚期 L4 和成虫阶段的 HSN 中表现出强表达，且未引起明显的 HSN 发育或产卵行为缺陷。该品系以及在腹侧神经索（VC）运动神经元、阴门肌肉和 uv1 神经内分泌细胞中表达 GCaMP5 和 mCherry 的其他品系均可从 Caenorhabditis 遗传学中心获取，其构建细节已有报道。
5. 从接种好的 NGM 琼脂平板上取 OP50 细菌，涂抹在铂金线虫挑针底部，用于转移约 20 只在 HSN 神经元中由 nlp-3 启动子驱动表达 GCaMP5 和 mCherry 的晚期 L4 阶段 LX2004 动物。在体视显微镜下确认其发育中的阴门呈现为一个清晰的暗斑，周围环绕着白色的新月形结构。将动物在 20 °C 下培养 24–40 小时。
6. 培养结束后，将少量 OP50 涂抹在挑针上，转移约 3 只线虫至未接种细菌的 NGM 平板上，保留少量食物供成像期间线虫取食。确保食物量适中：食物过少会导致线虫离开平板中心区域游走，而食物过多则会增加背景荧光并引发缺氧。
7. 使用扁平的圆头刮刀从培养平板上切下一块约 20 mm × 20 mm 的琼脂块，将其倒置放置于洁净的 24 mm × 60 mm #1.5 盖玻片中央（图 1）。从一侧开始操作，避免在盖玻片下产生气泡而干扰成像。在琼脂块顶部加盖一片 22 mm × 22 mm #1 盖玻片，以减少黏附和蒸发。

2. 硬件与仪器设置

1. 将处于特定发育阶段的转基因线虫放置在倒置显微镜的载物台上，显微镜需配备数值孔径 ≥ 0.7 的平场复消色差20倍物镜、可通过操纵杆控制的电动XY载物台、图像分光器，以及用于同时激发和发射GCaMP5和mCherry的荧光滤光片组、用于荧光和红外明场成像的相机，以及可触发的发光二极管（LED）照明系统（图2A）。
   ​注意： 80/20分光镜将80%的图像信号送至荧光相机，20%送至明场相机。也可使用正置显微镜，但此时NGM琼脂块应置于载玻片与大号盖玻片之间。
   1. 使用双目目镜选择待成像的线虫。选定个体后，将红外滤光片插入聚光镜上方。
2. 晶体管-晶体管逻辑（TTL）触发信号
   1. 将同轴电缆从荧光相机的三个TTL触发输出端口分别引出。将第一个输出连接至LED照明系统的BNC输入端口#3。
   2. 将第二个输出连接至BNC“香蕉头”适配器，其中绿色和棕色导线分别从8针GPIO连接器连接至红外相机的GPIO输入#3（引脚4）和接地（引脚5）。
   3. 将第三个输出连接至BNC“香蕉头”适配器，跳线分别连接至数字采集设备的#8数字输入端口和接地端口（图2B）。
3. 数字采集设备（DAQ）
   1. 通过USB线缆将DAQ微控制器板（见材料表）连接至计算机。使用标准Firmata协议更新固件（见材料表），并将USB端口配置为以57600波特率通信。
4. LED控制
   1. 运行LED控制器软件（见材料表）。将触发模式从“连续”切换至“门控”，并为470 nm和590 nm LED均选择触发通道“3”。
   2. 开启LED，并为每个LED设置功率（例如，将470 nm LED设为20%，590 nm LED设为40%）。
5. 在Bonsai中运行串行载物台通信脚本“XY-stage-final”（见材料表）。点击灰色的“CsvWriter”节点，并选择用于保存记录的X和Y载物台位置信息的文件夹（图3）。点击工具栏中的绿色箭头以初始化DAQ。
   注意： 当荧光相机发送TTL信号时，该脚本将开始记录X和Y载物台位置。该脚本输出四列数据：帧编号、X位置（µm）、Y位置（µm）以及帧间间隔（s）。
6. 在红外相机记录软件中（见材料表），于“自定义视频模式”下选择“模式1”（2×2 binning；1,024 × 1,024像素）和“像素格式Raw 8”。在“触发/闪光”设置中，将触发输入线（GPIO）设为“3”，极性设为“高”，模式设为“14”。启用“启用”选项，以在接收到TTL触发信号前暂停帧采集。
   1. 保持该窗口打开，点击主相机视图工具栏上的红色“录制”按钮。选择用于保存图像序列的文件夹。选择“缓冲”录制模式，并以JPEG格式保存“图像”。点击“开始录制”以初始化采集。
7. 荧光相机与图像分光器
   注意： 为确保比率定量分析时图像配准准确，必须同时采集GCaMP5和mCherry荧光通道信号。图像分光器可将GCaMP5和mCherry的双通道荧光信号投射至同一传感器上进行同步采集。
   1. 在图像采集软件的“采集”选项卡中（见材料表），设置曝光时间为10 ms，binning为4×，图像深度为16位。选择一个居中的相机子阵列，宽度为512像素，高度为256像素。点击“显示输出触发选项”，并将所有触发设为“正极性”。
      ​注意：若TTL触发信号持续时间等于或短于10 ms，DAQ可能偶尔丢失触发信号。
   2. 确保“触发1”和“触发2”设为“曝光”，而“触发3”设为“可编程”，周期为25 ms。在“序列”选项卡下，选择“时间间隔”模式，设置“场延迟1”为50 ms，以实现20 Hz的图像采集频率。选择“保存至临时缓冲区”。
8. 三通道共聚焦成像过程中的PMT增益与激光强度
   1. 调节PMT增益，使背景荧光略高于最低值（黑电平）。逐步增加561 nm（绿色）激光功率，直至在mCherry通道中观察到突触前末端出现单个饱和的12位或16位像素。
   2. 调节488 nm（蓝色）激光强度，使GCaMP5荧光在突触前末端刚好可见且略高于背景。此低强度设置可防止在强Ca²⁺瞬变引起荧光增强时GCaMP5像素饱和。将共聚焦针孔完全打开，以最大化光信号采集效率。

3. 比值法 Ca²⁺ 成像与行为记录

1. 在荧光采集软件的“序列”选项卡下，点击“开始”以启动记录。使用操纵杆跟踪线虫，使感兴趣的细胞及突触保持在视野（FOV）中央并处于焦平面。点击直方图窗口中的“统计”按钮，以显示各通道的像素统计信息。
2. 调节LED功率，确保在突触前末端处单个像素的mCherry荧光信号达到至少8,000计数（约4,000个光电子），从而在背景信号（约100个光电子）之上提供约12位的动态范围。在静息（低）Ca²⁺状态下，突触前末端的GCaMP5信号应约为2,500计数——略高于背景，清晰可见。
3. 持续记录直至达到一次产卵活跃状态；通常在野生型线虫中每20-30分钟发生一次。保存一段10分钟的子集（共12,001帧），包含产卵事件首次发生前后各6,000帧（事件发生于第6,001帧）。务必同步保存相应时间段的明场图像（记录线虫行为）以及XY载物台位置的时间点，否则将导致数据流无法精确同步。
4. 使用ImageJ及BioFormats插件（参见材料表）将图像序列转换为图像细胞计量标准格式（.ics），以便导入至比率定量分析软件中。

结果

图 1. C. elegans 固定技术用于高分辨率成像卵产出行神经回路活动与行为。 上图：从侧面观察的最终固定状态；下图：透过大号盖玻片底部观察到的最终固定状态。箭头指示夹在 NGM 琼脂块与大号 24 mm × 60 mm 盖玻片之间的 OP50 细菌食物、C. elegans 线虫及卵。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
秀丽隐杆线虫的培养、饲养与制片
大肠杆菌菌株 OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心	OP50	秀丽隐杆线虫的食物。尿嘧啶营养缺陷型。大肠杆菌B株。生物安全等级1级
HSN GCaMP5+mCherry 蚓株	秀丽隐杆线虫遗传中心	LX2004	使用 nlp-3 启动子驱动 HSN 中 GCaMP5 和 mCherry 表达的整合型转基因。完整基因型： vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) 突变株用于转基因制备	作者	LX1832	用于在显微注射后回收高拷贝转基因的菌株，携带 pL15EK lin-15(n765ts) 救援质粒。同时具有连锁的 lite-1(ce314) 突变，可降低对蓝光的敏感性。可通过联系作者申请获取
pL15EK lin-15a/b 基因组拯救质粒	作者	pL15EK	用于将质粒注射至LX1832后拯救转基因动物的救援质粒 lite-1(ce314)，lin-15(n765ts) X 品系。可应要求向作者索取
pKMC299 质粒	作者	pKMC299	用于在HSN神经元中由nlp-3启动子驱动mCherry表达的质粒，含有nlp-3 3'非翻译区
pKMC300 质粒	作者	pKMC300	用于在 nlp-3 启动子驱动下于 HSN 神经元中表达 GCaMP5 的质粒。含有 nlp-3 的 3' 非翻译区
磷酸二氢钾	Sigma	P8281	NGM 平板的制备
磷酸氢二钾	Sigma	P5655	NGM 平板的制备
七水合硫酸镁	Amresco	662	NGM 平板的制备
二水合氯化钙	Alfa Aesar	12312	NGM 平板的制备
蛋白胨	Becton Dickinson	211820	NGM 平板的制备
氯化钠	Amresco	241	NGM 平板的制备
胆固醇	Alfa Aesar	A11470	NGM 平板的制备
琼脂，细菌级A型，超纯	Affymetrix	10906	NGM 平板的制备
60 mm 培养皿	VWR	25384-164	NGM 平板的制备
24 x 60 mm 微型盖玻片，#1.5	VWR	48393-251	用于成像线虫的盖玻片
22 x 22 mm 微型盖玻片，#1	VWR	48366-067	覆盖在琼脂块顶部的盖玻片
带透射光源底座的立体显微镜	Leica	M50	用于线虫品系维护、分期和制片的解剖显微镜
铂铱合金丝（80:20），0.2 mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	用于线虫转移
钙成像显微镜
防振气浮台	TMC	63-544	Micro-g' Lab Table 30" × 48" 带有4个的防震台" 25毫米顶盖的CleanTop M6
倒置复合显微镜	Zeiss	431007-9902-000	Axio Observer.Z1 倒置显微镜
侧端口 L80/R100（3 位）	Zeiss	425165-0000-000	将20%的输出导向明场（CMOS）相机，80%导向荧光（sCMOS）相机
倾斜背光照明载具	Zeiss	423920-0000-000	用于红外/行为成像
12V/100W 带集光器的灯罩	Zeiss	423000-9901-000	用于红外/行为成像
卤素灯 12V/100W	Zeiss	380059-1660-000	用于红外/行为学成像。白光LED不发射显著的红外光，因此在使用红外带通滤光片后无法实现明场成像。
32 mm 红外带通滤光片（750-790 nm），用于卤素灯	Zeiss	447958-9000-000	BP 750-790；DMR 32mm，用于明场和行为观察的红外照明
6孔滤光片转盘式聚光镜（LD 0.55 H/DIC/Ph），电动	Zeiss	424244-0000-000	用于红外/行为成像
聚光镜 & 快门	Zeiss	423921-0000-000	用于红外/行为成像
带光导管的双目目镜，用于红外CMOS相机	Zeiss	425536-0000-000	用于红外/行为成像
目镜 10x，23 mm	Zeiss	444036-9000-000	用于线虫在琼脂块上的定位
C型接口转接器 2/3" 0.63倍减倍镜	Zeiss	426113-0000-000	红外CMOS相机支架
用于红外明场和行为观测的CMOS相机（1" 传感器	FLIR（前身为 Point Grey Research）	GS3-U3-41C6NIR-C	用于明场成像的相机
USB 3.0 主机控制器卡	FLIR（前身为 Point Grey Research）	ACC-01-1202	Fresco FL1100，4端口
8 针，1 米 GPIO 电缆，Hirose HR25 圆形连接器	FLIR（前身为 Point Grey Research）	ACC-01-3000	用于TTL触发的电缆。绿线连接至GPIO3 / 引脚4，棕线连接至接地 / 引脚5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27	Zeiss	420650-9901-000	最佳的放大倍数、数值孔径与工作距离组合
6立方反射镜转台，电动	Zeiss	424947-0000-000	用于荧光成像
荧光光路切换装置，电动	Zeiss	423607-0000-000	用于荧光成像
荧光快门	Zeiss	423625-0000-000	用于荧光成像
GFP 和 mCherry 双激发与发射滤光立方体（用于显微镜）	Zeiss	489062-9901-000	FL滤光片组62 HE BFP+GFP+HcRed，用于荧光成像
LED照明系统	Zeiss	423052-9501-000	可触发的 Colibri.2 LED 荧光照明系统
GFP LED 模块（470 nm）	Zeiss	423052-9052-000	用于GFP荧光激发的Colibri.2 LED
mCherry LED 模块（590 nm）	Zeiss	423052-9082-000	用于 mCherry 荧光激发的 Colibri.2 LED
透射光设备用虹膜光圈滑块	Zeiss	000000-1062-360	调节场光阑光圈以限制LED照明范围至相机视野内
C型接口转接器 1" 1.0x	Zeiss	426114-0000-000	图像分光器与sCMOS荧光相机适配器
图像分束器	滨松	A12801-01	Gemini W-View，也可使用其他图像分光器，但它们可能未针对sCMOS相机的大传感器尺寸进行优化
GFP / mCherry 二向色镜（图像分光器）	Semrock	Di02-R594-25x36	将GCaMP5、mCherry与红外信号分离
GFP发射滤光片（图像分光器）	Semrock	FF01-525/30-25	捕获 GCaMP5 荧光
mCherry/发射滤光片（图像分光器）	Semrock	FF01-647/57-25	该滤光片用于排除明场成像所用的红外光，是必需的
用于荧光成像的sCMOS相机（1" 传感器）	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2。更新的型号支持对传感器的两个半区分别设置图像采集参数，可结合图像分光器实现双通道图像的采集。
电动XY载物台	Märzhäuser	SCAN IM 130 x 100	载物台移动；该载物台的XY方向分辨率为0.2µ每步 m
带操纵杆的XY轴载物台控制器	LUDL	MAC6000，XY操纵杆	手动追踪线虫。MAC6000控制器应通过串行（RS-232）端口连接至计算机，波特率设置为115200
数字采集板（DAQ）	Arduino	Uno	接收来自sCMOS相机的TTL触发信号。Uno应加载标准Firmata程序包，并将计算机USB端口配置为57600波特率
BNC公头至BNC公头线缆 - 6英尺	Hosa Technology	HOBB6	用于 TTL 触发的 BNC 连接器
镀金 BNC 公头转 SMA 公头同轴电缆（8.8")	uxcell	6.08642E+11	连接荧光相机触发输出
BNC 转接头	Hantek	RRBNCTH21	BNC 转香蕉插头适配器（4 mm）
BNC 雌头至雌头连接器	Diageng	20130530009	用于将相机的BNC输出端连接至香蕉插头的母对母BNC转接器
无焊柔性面包板跳线	Z&T	GK1212827	将BNC触发输出端连接至Arduino数据采集设备，使用公对公BNC线缆。
高性能工作站	HP	Z820	Windows 7，64 GB RAM，双路 Xeon 处理器，固态 C 盘，串行（RS-232）端口，多个用于以太网连接的 PCIe3 插槽，USB 3.0 扩展卡，以及额外的固态硬盘
M.2 固态硬盘	三星	MZ-V5P512BW	图像数据的高速传输与分析
M.2 固态硬盘适配器，用于工作站	莱科姆	DT-120	M.2 转 PCIe 3.0 4 通道适配器
网络附加存储	Synology	DS-2415+	成像数据存储与分析
硬盘驱动器	西部数据	WD80EFZX	RED 8 TB，5400 RPM 级 SATA 6 Gb/s，128MB 缓存，3.5 英寸。用于成像数据存储（10 块硬盘 + 2 块硬盘冗余）
软件
荧光采集	Hamamatsu	HCImage DIA	以 20 fps 采集双通道（GCaMP5 和 mCherry）荧光图像序列的记录
明场图像采集	FLIR（前身为 Point Grey Research）	Flycapture	明场JPEG图像序列的录制
串口读取器	Bonsai	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	便于在行为过程中追踪线虫
LED控制器软件	Zeiss	微型工具箱测试 2011	设置 Colibri.2 单元中不同 LED 的强度和触发输入
ImageJ	NIH	https://imagej.net/Fiji/Downloads	图像序列的简易回顾及为导入Ratiometric Quantitation软件而进行的格式转换
Excel	Microsoft	2002984-001-000001	用于从 Volocity 生成适用于 MATLAB 分析的逗号分隔值数据子集
峰值检测	MATLAB	R2017a	用于计算比率峰值特征的脚本
比率定量	Perkin Elmer	Volocity 6.3	有助于计算比率成像通道、通过图像分割进行目标识别，以及对识别出的目标进行比率测量
脚本
AnalyzeGCaMP_2017.m	MATLAB	平均比率与XY质心脚本	分析以 .csv 格式输出的比率数据，整合对象与质心位置，计算比率变化（ΔR/R），识别峰及峰特征，并以 Postscript 格式生成图表（含或不含标注的峰）。对于矩阵文件的导入，该脚本将输出数据至三个文件夹：analyzed、peaks 和 traces。“analyzed”输出为包含六个列（单位）的整合对象矩阵文件：时间（s）、面积（平方微米）、比率、X 质心（微米）、Y 质心（微米）以及 ΔR/R。“峰值”输出是一个矩阵文件，包含检测到的峰值的时间点及其幅度（以 ΔR/R）、峰宽（s）以及峰的显著性。"Traces" 输出为钙信号轨迹的 Postscript 文件。
XY-stage-final.bonsai	Bonsai	TTL 触发的 DAQ 与载物台位置串口读取器	当连接的 Arduino 在 sCMOS 相机帧曝光期间接收到正向 TTL 信号时，记录 X 和 Y 轴的载物台位置（单位：微米）。脚本生成一个包含四列的 .csv 文件：帧编号、X 位置（微米）、Y 位置（微米）以及帧间经过的时间（以 20 fps 采样时通常约为 50 毫秒）。该输出结果中的 X 和 Y 载物台位置（分别为第 2 和第 3 列）将与 AnalyzeGCaM 提取的 X 和 Y 质心位置相加。