记录脑切片中脚桥核神经元的伽马频段振荡

摘要

来源：Urbano, F. J. 等，et al. 记录脚桥核神经元中的伽马频段振荡。J. Vis. Exp. (2016)。

该视频展示了记录PPN神经元中伽马波段振荡的方法。通过在含突触阻断剂的aCSF中使用矢状脑切片，并施加正向电流脉冲 通过 使用膜片钳电极开启钙通道，诱导产生对清醒状态至关重要的阈下活动。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 标准人工脑脊液（aCSF）的制备

1. 储备液 A 的配制
   1. 在添加化学试剂前，向一个洁净的 1 L 烧杯中加入 700 ml 蒸馏水。
   2. 在持续搅拌约 500 ml 体积的同时，加入 136.75 g NaCl、6.99 g KCl、2.89 g MgSO₄ 和 2.83 g NaH₂PO₄。
   3. 继续添加蒸馏水至最终体积为 1 L。稀释后，各化合物的终浓度分别为 117 mM NaCl、4.69 mM KCl、1.2 mM MgSO₄ 和 1.18 mM NaH₂PO₄。
   4. 4 °C 冷藏保存，最多可保存 2 周。
2. 储备液 B 的配制
   1. 在添加化学试剂前，向一个洁净的 1 L 烧杯中加入 700 ml 蒸馏水。
   2. 在持续搅拌约 500 ml 体积的同时，加入 41.45 g D-葡萄糖和 41.84 g NaHCO₃。
   3. 继续添加蒸馏水至最终体积为 1 L。稀释后，各化合物的终浓度分别为 11.5 mM D-葡萄糖和 24.9 mM NaHCO₃。
   4. 4 °C 冷藏保存，最多可保存 2 周。
   5. 每次实验前，将 50 ml 储备液 A 与 50 ml 储备液 B 混合，并用蒸馏水定容至 1 L，得到终浓度的 aCSF 溶液，同时在室温下持续用碳酰气（95% O₂ - 5% CO₂ 混合气）充氧至少 30 分钟。终浓度 aCSF 溶液仅在每次实验开始时新鲜配制，并于当日实验结束后弃去。

2. 蔗糖-人工脑脊液（Sucrose-aCSF）的制备

1. 储备液 C 的配制
   1. 在添加化学试剂前，向一个洁净的 1 L 烧杯中加入 700 ml 蒸馏水。
   2. 在持续搅拌 500 ml 蒸馏水的同时，依次加入 240 g 蔗糖、6.55 g NaHCO₃、0.671 g KCl、4.88 g MgCl₂、0.22 g CaCl_2, 和 0.21 g 抗坏血酸。
   3. 继续加入蒸馏水至最终体积为 1 L。稀释后，各组分的终浓度分别为 701.1 mM 蔗糖、78 mM NaHCO₃、9 mM KCl、24 mM MgCl₂、1.5 mM CaCl_2, 和 1.2 mM 抗坏血酸。
   4. 将储备液 C 置于 4 °C 保存，最多可使用一周。
   5. 每次实验前，取 50 ml 储备液 C 与 300 ml 蒸馏水混合，再加入 600 ml 蒸馏水，配制成终浓度的蔗糖-aCSF 溶液。在室温下持续用碳氧混合气（95% O₂ - 5% CO₂）供氧至少 30 分钟。

3. 切片制备

1. 将一个洁净的烧杯中加入100 ml蔗糖-人工脑脊液（sucrose-aCSF）溶液并置于冰上，同时用碳氧混合气（carbogen）供氧，并使用pH计监测pH值，通过滴加几滴0.1 M NaOH溶液（当pH < 7.4时）或0.1 M HCl溶液（当pH > 7.4时）将pH值调节至7.4。
2. 向振动切片机的切片室中充满蔗糖-aCSF并持续供氧。启动与切片室相连的基于甘油的制冷系统，等待15分钟，使其冷却至0 - 4 °C。
3. 使用氯胺酮（Ketamine，70 mg/kg，i.p.；终体积< 50 µl）对幼鼠（来自成年定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠，日龄9至12天）进行麻醉。当幼鼠安静后，再次确认其尾夹反射消失。
4. 断头处死幼鼠。
   1. 使用碳素钢手术刀片从头部前端向后端纵向切开头皮，用镊子将皮肤向两侧拉开。剪开覆盖脑组织的颅骨，将剪刀向侧方移动，完全移除颅骨以暴露脑组织。
   2. 随后，用刮铲迅速取出脑组织（先将刮铲置于嗅球下方，轻柔地从最前端向最后端推动以分离脑组织），并将脑组织轻轻推入预冷的、充氧的蔗糖-人工脑脊液（sucrose-aCSF）中。
5. 对右侧半球进行旁矢状面切割（切除约三分之一的半球），将修整后的脑组织切面粘附于金属圆盘上，该圆盘将通过磁力固定在振动切片机的切片室中，用于切割包含脚桥核（pedunculopontine nucleus, PPN）的矢状面400 µm厚切片。在进行全细胞膜片钳记录前，将含PPN的脑片在室温（RT）下孵育45分钟。

4. PPN 切片中伽马波段振荡的记录

1. 高钾葡萄糖酸钾细胞内液的配制
   1. 将一个洁净的烧杯加入10 ml蒸馏水后置于冰上。在持续搅拌的同时，依次加入：K+-葡萄糖酸盐 90.68 mg，磷酸肌酸二-Tris盐 47.66 mg，HEPES 1.5 mg，EGTA 40.58 mg，Mg²⁺-ATP 和 4 mg Na⁺₂-GTP
   2. 用 KOH（蒸馏水中 100 mM）调节 pH 至 7.3。加入蒸馏水定容至终体积 20 mL。如有需要，用蔗糖（蒸馏水中 100 mM）调节渗透压至 280–290 mOsm。稀释后，各组分的终浓度分别为 124 mM K+-gluconate、10 mM phosphocreatine di Tris salt、10 mM HEPES、0.2 mM EGTA、4 mM Mg²⁺-ATP 和 0.3 mM Na⁺₂-GTP
   3. 将细胞内液分装至1 ml离心管中，于-20 °C冷冻保存。每次实验使用一份分装样品，并在实验过程中置于4 °C保存。
2. 全细胞膜片钳记录
   1. 将切片置于浸没式切片记录室中，并以充氧人工脑脊液（95% O₂₂ -  5% CO₂) 含有以下受体拮抗剂的 aCSF：选择性 NMDA 受体拮抗剂 2-氨基-5-磷酸戊酸（APV，40 μM）、竞争性 AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体拮抗剂 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX，10 μM）、甘氨酸受体拮抗剂士的宁（STR，10 μM）以及特异性 GABA_A 受体拮抗剂加巴青（gabazine, GBZ, 10 μM）和钠通道阻断剂河豚毒素（tetrodotoxin, TTX, 3 μM）
      ​使用市售的带溶液滤器的膜片钳移液管填充装置，将细胞内高K+溶液注入记录用膜片移液管中（电阻为2-7 MΩ，由外径1.0 mm、内径0.6 mm的常规市售厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管拉制而成）。将移液管插入放大器的移液管固定器中。通过连接在移液管固定器上的硅胶管和三通阀，使用1 ml注射器向移液管内施加轻微正压。将移液管固定器后端连接至膜片钳放大器。
   2. 使用机械显微操作器，在4倍物镜结合近红外微分干涉相差光学系统下，将记录电极移至PPN核团附近。
      注意： PPN核团可于小脑上脚（SCP；可见为一束粗大的轴突）背侧的切片中观察到。记录电极置于PPN内。 致密部位于柄后端背侧紧邻处。
   3. 使用40倍水浸物镜观察，将记录电极接触PPN神经元，并迅速施加负压以在细胞上形成封接。
   4. 使用电压钳封接软件，按照制造商方案，在施加负压吸引时监测移液管电阻。
      1. 当缓慢增加负压，且膜片钳监测器在移液管尖端测得的阻值达到80 - 100 MΩ时，迅速将钳制电位改变为-50 mV，并释放负压。持续施加负压，直至细胞膜破裂，实现全细胞记录模式下的电学接触。
      2. 如果电压钳封接软件测得的接入电阻值为 10 MOhm 或更高，则继续以较小幅度施加负压吸引。
   5. 补偿电容（即，破膜后观察到的慢相和快相瞬时电流）以及电压钳模式下的串联电阻。切换记录模式至电流钳，并快速补偿桥接电阻值（例如，移动放大器旋钮或使用计算机鼠标点击自动补偿菜单）。
      1. 持续监测所记录的PPN神经元的静息膜电位，按照制造商的方案进行操作。若静息膜电位向去极化或超极化方向偏移，则使用少量直流电流（最多100 pA）将其维持在最佳终值-50 mV。
         注意： 仅保留静息膜电位（RMP）为-48 mV或更超极化的PPN神经元即，RMP < -48 mV

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, 分子量 = 342.30
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, 分子量 = 84.01
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, 分子量 = 74.55
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, 分子量 = 203.30
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, 分子量 =147.02
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, 分子量 = 180.16
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, 分子量 =176.12
氯化钠	Acros Organics	327300025	NaCl, 分子量 = 58.44
葡萄糖酸钾	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, 分子量 = 234.25
磷酸肌酸二(三)盐	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, 分子量 = 453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, 分子量 = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, 分子量 = 380.40
三磷酸腺苷镁盐	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, 分子量 = 507.18
三磷酸鸟苷钠盐水合物	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, 分子量 = 523.18
河豚毒素柠檬酸盐	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, 分子量 = 319.27
DL-2-氨基-5-磷酸戊酸	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, 分子量 = 197.13
CNQX 二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, 分子量 = 276.12
士的宁	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, 分子量 = 334.41
美加明盐酸盐	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, 分子量 = 203.75
加巴青 (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, 分子量 = 368.23
氯胺酮盐酸盐	Mylan	67457-001-00
显微镜	Nikon	Eclipse E600FN
显微操作器	Sutter Instruments	ROE-200
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D 转换器	Molecular Devices	Digidata 1440A
加热器	Warner Instruments	TC-324B
泵	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
泵管组件	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
移液管拉制仪	Sutter Instruments	P-97
相机	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
振动切片机	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
制冷系统	Vibratome Instruments	900R
设备
显微镜	Nikon	Eclipse E600FN
显微操作器	Sutter Instruments	ROE-200
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-200
放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D 转换器	Molecular Devices	Digidata 1440A
加热器	Warner Instruments	TC-324B
泵	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
泵管组件	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
移液管拉制仪	Sutter Instruments	P-97
相机	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C