在小鼠脑内植入电极组件用于电生理记录

摘要

来源：Straub, J., 等 VGAT-Cre 小鼠电点燃电极的制备与植入以建立颞叶癫痫模型。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种将电极组件植入小鼠脑内的技术。该组件包含双极电极，用于记录海马区的神经活动，以及一个参考电极，用于获取小脑区域的基线活动信号。将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪上，随后将电极组件植入目标脑区。术后动物恢复一段时间，随后进行电生理记录。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 制作带有两个双极电极的耳机（图1）

1. 剪取一段长度为 3.5 cm 的不锈钢聚四氟乙烯涂层不锈钢丝。
2. 将导线两端的绝缘涂层剥离约 1 mm。注意不要剥离过多导线。
3. 将两个插针插入台钳夹具中，插针底部较长的狭缝朝下。
4. 在导线裸露的两端以及插针顶部涂抹助焊剂。
5. 用适量焊料对导线裸露部分进行镀锡，确保完全覆盖即可。
6. 在插针顶部添加极少量焊料，避免溢出至侧面。
7. 当焊料熔化时，将导线一端裸露部分尽可能深入地插入插针中。
   注意： 插针侧面有孔，导线可能从此孔穿出——请勿让导线从插针中穿出。所有裸露的导线部分必须完全保留在插针内部。
8. 对第二个插针重复步骤 1.6–1.7，使用导线另一端的裸露部分。
9. 让插针静置 30 秒使其固定，然后从台钳夹具上取下，并轻轻拉扯以确认导线与插针之间的连接牢固可靠。
10. 用冷水冲洗插针，然后将其擦干。
11. 使用欧姆表检测插针 1 与插针 2 之间的导通性。
12. 将导线两端的插针靠拢并保持平行且紧密贴合。用止血钳夹住导线中部，然后旋转止血钳，使导线自身紧密缠绕。随后取下止血钳。
13. 用镊子夹住插针下方 2 mm 处的绞合导线，并将导线弯成 90˚ 角。
14. 再次将同一导线在镊子上方反向弯曲 90˚，形成第二个弯折点，距离第一个弯折点 1 mm。
15. 使用小型锋利剪刀，在第二个弯折点下方 3.5 mm 处以 45° 角剪断绞合导线。
16. 为每个头戴装置准备两个双极（双插针绞合）电极（可选：第二个作为备用，以防第一个出现电气问题）。
17. 通过将一端带有插针并已焊接的导线（步骤 1.1–1.17）剪成两段，制备一个单参考电极（图 1A）。
18. 将导线剪至 7 mm 长。
19. 在尖端下方 1 mm 处弯曲导线末端。
20. 然后用镊子夹住导线弯曲的 1 mm 尖端，围绕镊子紧密旋转导线，形成一个直径为 1 mm 的小环。
21. 将该环弯折至与导线直段部分垂直，使导线尖端再次向外伸出。
22. 将两个双极电极和一个单参考电极组装到六针基座上，使两个双极电极并排放置，间距为 6 mm，参考电极置于中间外侧孔中（图 1B）。
    注意： 另一种方法是先植入电极并用牙科水泥固定，再将插针插入基座中。

2. 立体定向电极植入

1. 手术前通过高压灭菌器对所有手术器械和六针电极组件进行灭菌。手术过程中必须维持无菌手术区域，并使用无菌外科手套。建议使用无菌巾（例如 Press n' Seal）覆盖动物，仅暴露手术区域。
2. 选用8周龄的VGAT-Cre小鼠（在囊泡GABA转运蛋白[VGAT]基因启动子控制下表达Cre重组酶，年龄匹配，雄性和雌性均可）进行断奶后4周的手术。术前记录动物体重，以便测量术后体重减轻情况。
3. 使用经过认证的异氟烷挥发罐或配备精密注射泵、集成数字挥发罐和反馈加热垫的低流量麻醉系统。
   注意：低流量系统可根据动物体型以低流速（70 mL/min）向诱导室或立体定位仪上的鼻罩输送麻醉气体（空气中异氟烷浓度诱导时为4%，手术时为2%）。减少麻醉剂使用不仅有利于动物在手术期间的健康，还可降低实验室人员接触异氟烷的风险。
4. 将麻醉后的动物置于加热垫上，温度维持在37 °C，以保证手术期间体温。若使用反馈控制的温控系统，应将少量润滑的温度探头插入动物直肠，用于术中体温监测。
5. 将动物固定于立体定位仪上，轻轻将耳杆插入耳道，上门齿钩住门齿杆。将鼻罩罩住鼻部，确保麻醉气体正确输送。确保头部水平居中，在轻微触碰时不会移动。
6. 皮下注射0.5 mL的等渗溶液（normosol）以维持水合状态。
7. 涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。
8. 通过夹捏后肢脚趾无回缩反射来判断麻醉深度，随后在手术期间将异氟烷浓度降至1.5%-2.0%。
9. 通过拔毛、剪毛（剃毛）或使用脱毛膏去除手术区域及其周围的毛发，并用碘伏和乙醇交替擦拭三次进行皮肤消毒，最后以碘伏结束。仅当能够在该位置维持麻醉时，才建议在远离手术部位的区域去毛。如有必要，可用蘸酒精的棉签清除头部周围紧邻区域的毛发。皮下注射0.05 mL局部镇痛药布比卡因（0.25%）。
10. 使用手术刀在颅骨上做切口，然后用锋利的手术剪剪除部分皮肤，暴露颅骨。用棉签将皮肤推开，清洁颅骨表面，去除所有阻碍视野的肌肉和深层组织。
    注意：如发生意外出血，应用无菌棉签在出血部位施加压力直至止血。
11. 使用无菌棉签蘸取过氧化氢清洁颅骨，使颅骨缝线以及前囟（bregma）和后囟（lambda）清晰可见。
12. 彻底干燥颅骨后，使用其配套工具滴加一滴自酸蚀牙科粘合剂。用刷子将其涂布于颅骨表面，等待60秒，再用牙科紫外灯照射40秒使其固化。光亮的表面表明粘合剂已与颅骨有效交联。
    注意：此步骤对头戴装置的牢固固定至关重要。
13. 使用0.031英寸（0.79 mm）钻头在双侧钻出两个骨孔，用于植入海马深度电极（转速约5,000 rpm）。在后囟后方的小脑上方额外钻一个骨孔，用于参考电极。
    ​注意：钻孔时应缓慢下钻，避免钻入脑组织。
14. 电极坐标如下（从前囟bregma起，单位为mm）：海马电极位于后方3 mm、外侧3 mm、深度3 mm；小脑参考电极位于后方6 mm、中线0 mm、深度0 mm（硬膜下）。
15. 为提高准确性，使用安装在立体定位仪上的钻头，当钻头接触前囟时将立体定位操纵器的X/Y轴归零——此点即为坐标的参考点。
16. 将所有电极插入六针基座中组装头戴装置，确保针脚完全插入基座。将基座安装到立体定位仪上的电极固定器中（图1B）。
17. 将电极对准相应的骨孔上方。通过缓慢降低头戴装置，引导电极进入骨孔，立体定位植入双极不锈钢绞合丝电极至左右海马，参考电极植入小脑。
18. 当海马绞合电极正好位于骨孔上方时，将Z轴归零并缓慢下降至-3.0 mm。
19. 用牙科水泥覆盖颅骨表面和电极，并填充颅骨表面与基座底部之间的空隙。皮肤边缘应紧贴牙科水泥，确保无深层组织暴露。等待水泥干燥硬化后，将电极固定器从立体定位臂上拆下，并从基座上取下固定器。
20. 皮下注射0.1 mL酮洛芬（1 mg/mL，皮下[SC]）用于镇痛，并再次皮下注射0.5 mL等渗溶液（normosol）以维持水合状态，随后将动物从立体定位仪上取下。
21. 在铺有纸巾的空饲养笼内放置预热至37 °C的等温垫。待动物完全清醒后，将其放入含有垫料和软食的清洁笼中，并送回动物房。此后动物需单笼饲养，以防相互啃咬头戴装置。不使用金属杆料斗，以免头戴装置被卡住；改为将水瓶绑在笼盖下方，饲料置于垫料中。
22. 术后72小时内为动物提供软食，并监测体重变化和体况评分。若动物脱水（表现为体重下降、皮肤弹性增加、眼球凹陷），可皮下给予0.5 mL等渗溶液（normosol）。术后可每日皮下注射酮洛芬一次，持续两天（具体镇痛方案应遵循当地机构动物护理与使用委员会[IACUC]的指南）。动物在笼中完全恢复4-7天后，方可转移至脑电图（EEG）记录系统。

结果

图 1：脑电帽制备的关键步骤。（A）电极在不同制备步骤中的外观（左侧数字对应相应步骤）。（B）最终产品安装于自制支架中，该支架可适配立体定位仪。注意，支架末端为一个套环针组件，可插入脑电帽底座中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16通道细胞外差分交流放大器（115V/60Hz）	AD Instruments	AM3500-115-60	替代脑电图放大器
363/CP 插头套管，带针套筒	P1 Technologies	363SLEEVPIN0NL	用于电极夹持器
电缆，363-363 5厘米 - 100厘米，带屏蔽网 6TCM	P1 Technologies	363363XXXXCM004	小鼠至换向器电缆
闭路电视摄像机 Qcwox HD Sony 红外LED	Sony	QC-SP316
换向器 SL6C/SB（单刷）	P1 Technologies	8BSL6CSBC0MT	原Plastics One, Inc.
电流放大器	A-M Systems	Model 2100
牙科水泥	Stoelting	51459
钻头，#75，外径0.310" LOC 130 PT	Kyocera	105-0210.310
E363/0 斜向插座触点	P1 Technologies	8IE3630XXXXE	连接器用针脚
iBond 自酸蚀粘接剂	Kulzer	CE0197
MS363 基座 2298 6针 白色	P1 Technologies	8K000229801F	脑电图头戴设备连接器
欧姆表	Simpson	260	高灵敏度
PowerLab 16/35 和 LabChart Pro	AD Instruments	PL3516/P	替代脑电图软件
SomnoSuite	Kent Scientific Corp.	SS-01	麻醉装置 & RightTemp 监测
立体定位钻机和微型电机套件	Foredom Electric Co.	K.1070
立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 940
用于深部电极的聚四氟乙烯涂层导线，外径0.008'	A-M Systems	791400
VGAT-Cre 小鼠，近交系C57BL/6J背景	The Jackson Laboratory	664