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1. 取样设置和准备
- 在厄尔平衡盐溶液 （EBSS） 中补充碳酸氢钠（每 100 mL EBSS 0.44 g）和葡萄糖（每 100 mL EBSS 0.884 g）9。用 DEPC（每 100 mL EBSS 0.1 mL）在 37 °C 下在带螺口的可高压灭菌瓶或烧瓶中处理 EBSS 至少 12 小时。
- 将 5 3/4 英寸玻璃巴斯德移液管放入 1000 mL 玻璃烧杯中，然后将刷毛朝上的艺术家刷放入 100 mL 玻璃量筒中。添加足够的 DEPC 溶液（每 100 mL ddH2O/0.1 mL）分别覆盖移液管和刷子。用铝箔盖住烧杯和量筒，并在 37 °C 下孵育至少 12 小时。
- 与 DEPC 孵育 12 小时后，将所有经 DEPC 处理的材料加热至 >100 °C 的温度至少 15 分钟。取出 EBSS 并冷却至室温，然后在 4 °C 下储存。将 ddH2O 从烧杯和量筒中取出;继续在 >100 °C 下孵育，直到材料干燥。取出，冷却至室温，储存以备后用。
- 在实验当天，用 RNaseZap 处理所有工作表面。
- 将 EBSS 置于设定为 40 °C 的水浴中并保持。为了缓冲和充氧 EBSS，通过将气管放入无 RNase 的巴斯德移液器中并将移液管插入 EBSS，用 95%/5% O2/CO2 渗透。盖上 EBSS 容器的开口。
- 设置 Stoelting 组织切片机，用于脑组织的连续切片。用 RNaseZap 处理组织切片机的顶部和底部表面。将一块矩形的 Whatman #4 滤纸贴在生活用纸切碎机的有机玻璃表面上。 将双刃剃须刀片连接到切碎臂上。将千分尺设置为零，并调整切碎臂的最小高度，以允许剃须刀片切割滤纸，但不能切割有机玻璃板。
- 收集显微切割所需的所有额外材料，包括不含 RNase 的 60 x 15 mm 细胞培养皿、Harris Uni-Core 组织取芯器、200 μL 不含 RNase 的微量移液器吸头（用于在微量样品穿刺过程中对冠状脑切片进行 EBSS 氧合）、弯曲剪刀、干冰和组织采集管。将试管放在干冰上。
2. 脑切除和冠状切片
- 将鼠标放入 DecapiCone 中，并使用啮齿动物断头台斩首。从 DecapiCone 中取出头部并放在平坦的表面上。使用手术刀，从尾部开始到鼻孔约 3 毫米，沿着颅骨中线切开皮肤。横向剥开皮瓣，露出颅骨和眼窝。
- 使用弯曲的剪刀，切断两条视神经，切断它们与眼睛的连接。小心地折断枕骨和顶骨，并去除背顶骨和额骨，以打开颅腔。使用骨咬合器，打破鼻骨和泪骨，露出嗅球。用弯曲的剪刀将嗅球从喙脑上剪下来。切除整个大脑，后脑完好无损。将大脑放入 60 x 15 mm、无 RNase 的 Cellstar 细胞培养皿的顶部。转移到组织取样工作台面。
- 使用不含 RNase 的移液器用 EBSS 保守地润湿附着的组织切碎器上的滤纸。用 EBSS 润湿脑组织。
- 将大脑转移到组织切碎机并设置适当的方向。注意：大脑的位置应使腹面靠在滤纸上。中线（半球间裂）应垂直于切碎器刀片，大脑的喙缘应紧贴刀片。
- 使用经过 DEPC 处理的艺术家刷，通过对大脑的背表面施加轻柔的压力来保持大脑静止。在保持大脑静止的同时，将刀架杆抬高至背组织表面上方约 4-5 厘米处，并将其保持在该位置。从大脑表面取下刷子，并使用千分尺拨 750 μm。让杠杆下降，切碎组织并创建一个 750 μm 的冠状切片。
- 当切碎刀片保持静止时，用艺术家的刷子滚动，轻轻地将组织切片从刀片表面滑走。立即将组织切片放入培养皿中的含氧 EBSS 中。第二名研究者可以从步骤 3.1 开始。
- 重复步骤 2.5 和 2.6，直到在整个头尾平面上获得连续的脑切片。
3. 脑区显微解剖
- 调整照明以确保在组织显微切割过程中样品照明不会受到阻碍。调整 O2/CO2 的 95%/5% 混合物的位置和流量，以在显微解剖过程中为组织保持缓冲、充氧的环境。
- 确定包含感兴趣区域的冠状脑切片。使用艺术家的画笔将大脑切片平放在培养皿的底部。根据表 1 或其他参考资料选择具有适当直径的组织取芯器。用艺术家的刷子将冠状组织切片固定到位的同时，将组织取芯器的切割尖端向下放在组织切片的表面上。
- 在施加压力的同时，将组织取芯尖端压过组织切片并向下牢固地压在培养皿的底部。使用滚动圆周运动以确保感兴趣区域已与周围组织分离。小心地将组织取芯器从组织切片上提起，并释放微打孔器，使其漂浮在 EBSS 中。
- 使用艺术家的刷子，立即将组织微打孔器放入保存在干冰上的 -80 °C 稳定储存管中。组织应易于粘附在管的侧面。将含有微量样品的试管放回干冰中。
- 对每个感兴趣的大脑区域重复步骤 3.2 - 3.4。
4. 组织存档
- 显微切割完成后，使用 VisionMate 扫描仪系统记录每个含样品的 TrakMates 管的相应条形码。96 槽 TrakMates 试管架装满后，快速扫描试管架并立即将组织样品放入 -80 °C 冰箱中，直到提取 RNA。
5. 总 RNA 提取
- 使用 RNaseZap 准备无 RNase 的工作区。按照 MagMAX-96 总 RNA 分离方案10 中的说明，制备足量的磁珠混合物和裂解/结合溶液。
- 从 -80 °C 冰箱中取出组织样品，并将试管直接放在干冰上。
- 将 100 μL 裂解/结合溶液添加到含有样品的 TrakMates 管中。将无核酸酶的 0.5 ml 管状杵连接到沉淀混合器上并匀浆组织。使用低保留的无核酸酶移液器吸头，将匀浆样品转移到圆底 96 孔组织培养板上的孔中。立即使用低保留、无核酸酶的移液器吸头向样品中加入 60 μL 100% 异丙醇，并通过上下吹打 3-4 次进行混匀。
- 使用低保留、无核酸酶的移液器吸头向样品中加入 20 μL 微珠混合物。上下吹打 3-4 次，混合。
- 对所有组织样品重复步骤 5.3-5.4。
- 按照 MagMAX-96 总 RNA 分离方案步骤从 III.A.2 开始完成总 RNA 提取。注意：其他磁珠功能的总 RNA 分离试剂盒已上市;然而，本研究没有对他们进行检查。请参阅制造商的试剂盒手册，了解使用相应产品分离总 RNA 的详细信息。
- 使用 NanoDrop 3300 分光光度计或其他小体积分光光度计/荧光计技术测量所得总 RNA 的纯度和浓度。
6. 代表性结果：
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大脑区域/细胞核
组织取芯直径 （mm）
总 RNA （ng/μL）
260/280 比率
额叶皮层
2,0
27.03
1,99%
伏隔核 Nucleus Accumbens
1,0
6,26
2,77%
纹 状 体
1,5
27.94 元
2,19%
扣带皮层
1,5
29.05 元
2,07
下丘脑 - 室旁核 / 视交叉上核 （PVN/SCN）
2,0
40,34
2,03
丘脑
2,0
34.40 元
2.00 元
下丘脑 - 背内侧核 / 腹内侧核 （DMH/VMH）
2,0
44,83
2,05
杏仁 核
1,0
10,06
1,89%
海马体 - Ca 2/3
1,5
7,31
2,32
海马体 - Ca1/齿状回
1,5
5,20%
2,24
导水管周围灰色
1,0
48,21
2,02
中缝背核
1,0
6,56%
2,18 元
网状形成
2,0
35.35 元
2,27
表 1.具有各自最佳组织取芯直径、代表性总 RNA 产量和纯度的显微解剖小鼠脑区域的计数。13 个显微解剖的大脑区域，按头尾顺序列出，大小和方向各不相同。PVN/SCN 微穿刺包括前内侧室旁核、部分脑室周围核、脑室下区和其他细小细胞神经元。丘脑微打孔包括丘脑前核，与 PVN/SCN 微打孔区域位于同一冠状平面。DMH/VMH 微穿孔包括位于背内侧核和腹内侧核之间的副大细胞核和其他细小细胞神经元。杏仁核样本包括中央和基底外侧亚区。RNA 产量和 260/280 比率是从相应的显微切割样品中获得的单个值，用于演示从每个大脑区域获得的读数。