对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。
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本文内容
摘要
摘要
下一代测序、微阵列和qRT-PCR等技术平台在拓展我们对分子调控广度的理解方面具有巨大潜力。较新的方法，如高分辨率RNA测序（RNA-Seq）1，能够提供有关组织或状态特异性表达的新而广泛的信息，包括相对转录本水平、可变剪接以及微小RNA（micro RNAs）2-4。在特定组织内或表型不同的个体组之间，利用RNA-Seq方法进行比较性全转录组分析5，为揭示正常与异常生理状态下所涉及的分子机制提供了新的途径。最近，已在人类脑组织上开展了全转录组分析，鉴定了与疾病进展相关的基因表达差异6。然而，下一代测序技术在哺乳动物研究中的广泛应用仍有待进一步推进。
在小鼠模型中的基因表达研究已利用激光捕获显微切割技术（LCM）对不同脑核团进行样本分离，并报道了各自独特的表达谱7,8。尽管LCM能够以单细胞和特定脑区的精度进行样本采集，但该方法从小鼠脑组织中获得的总RNA产量相对较低，可能限制其在RNA测序及其他表达谱分析中的应用，并可能需要采用次优的样本扩增步骤。本文介绍了一种从小鼠特定脑区进行显微解剖及提取总RNA的实验方案。采用固定直径的组织打孔器，从单个小鼠脑组织连续冠状切片（厚度750 μm）中分离出13个脑区组织。显微打孔所得组织样本立即冷冻并存档。利用磁珠介导的总RNA分离技术从小份样本中提取总RNA。所获得的RNA样本在产量和质量上均满足后续表达谱分析的要求。该显微解剖策略为现有样本采集方法提供了一种可行替代方案，有助于从小鼠特定脑区获取总RNA，为新的基因表达发现提供了可能。
方案
1. 采样装置与准备
- 在 Earle 平衡盐溶液（EBSS）中添加碳酸氢钠（每 100 mL EBSS 加 0.44 g）和葡萄糖（每 100 mL EBSS 加 0.884 g）9。将 EBSS 加入焦碳酸二乙酯（DEPC）（每 100 mL EBSS 加 0.1 mL），置于带螺旋盖的可高压灭菌瓶或烧瓶中，37 °C 处理至少 12 小时。
- 将 5¾ 英寸玻璃巴斯德吸管放入 1000 mL 玻璃烧杯中，将画笔毛刷端朝上放入 100 mL 玻璃量筒中。分别加入足量 DEPC 溶液（每 100 mL ddH2O 加 0.1 mL）以浸没吸管和毛刷。用铝箔覆盖烧杯和量筒，37 °C 孵育至少 12 小时。
- DEPC 处理 12 小时后，将所有经 DEPC 处理的材料加热至温度 >100 °C，持续至少 15 分钟。取出 EBSS 并冷却至室温，随后于 4 °C 保存。将 ddH2O 从烧杯和量筒中倾倒出去，继续在 >100 °C 下孵育直至材料完全干燥。取出后冷却至室温，储存备用。
- 实验当天，使用 RNaseZap 处理所有工作台面。
- 将 EBSS 置于 40 °C 水浴中保温。为缓冲并氧合 EBSS，通过将气体管路插入无 RNase 的巴斯德吸管，并将该吸管插入 EBSS 中，通入 95%/5% O2/CO2 混合气体....
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讨论
本方案中有多个关键步骤需要仔细关注和考虑。首先，必须确定合适的组织钻孔器直径，以切除各自的目标区域。尽管表 1 中列出的组织钻孔器直径适用于所列脑区的取材，但每位研究者仍应根据自身感兴趣组织的最佳取材需求，确定合适的钻孔器尺寸。其次，本方法中报告的冠状切片厚度（750 μm）是经实验确定，在不同遗传背景的成年小鼠中均能最佳地识别目标脑区（表 1）。神经解剖学标志用于确认各目标区域的边界，这些标志在不同个体动物之间无差异。切片厚度可以调整；然而，若选择低于 500 μm 的切片厚度，将带来技术上的挑战，从而影响本显微解剖方法的有效性。最后，从动物断头至完成脑切片的最适时间应控制在 5 分钟内。在此时限结束前，所有冠状脑切片均应已置于充氧的 EBSS 培养基中。
采用磁珠技术进行总RNA分离可避免基于离心柱的RNA提取方法，显著缩短样本制备此阶段所需时间。此外，磁珠技术使实验方案具有可扩展性；高通量总RNA分离可使用市售的磁性颗粒处理系统。总之，本文所述的显微切割方法是一种易于实施、成本效益高且可扩展的实验方案，适用于多种研究领域，可用于利用新一代测序.......
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致谢
本工作由美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA）和陆军研究办公室（Army Research Office, ARO）资助，资助编号为 W911NF-10-1-006。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 水浴锅 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| 实验室旋转仪（轨道摇床） | 赛默飞世尔科技公司 | 2314 –- 1CEQ | |
| 颗粒混合器 | VWR 国际公司 | 47747-370 | |
| 无RNase 0.5 mL研磨杵 | VWR国际 | KT749521-0590 | 无核酸酶 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| 双面剃须刀片 | 斯托尔丁公司 | 51427 | |
| St–手动千分尺组织切片机 | Stoelting 公司 | 51425 | |
| 2/0号圆头画笔艺术家’s刷子 | 普林斯顿艺术刷 | 4350R | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔仪（0.75 mm） | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔仪（1.0 mm） | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔器（1.5 mm） | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔器（2.0 mm） | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| 断头台 | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | 赛默飞世尔科技公司 | SH30029.02 | |
| 25 mL 移液管 | Corning | 4489 | 无核酸酶 |
| epT.I.P.S. LoRetention 双滤芯吸头，20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| TrakMates 带盖螺口管 | 赛默飞世尔科技公司 | 3741 | |
| VisionMate 无线 2D 条形码阅读器 | 赛默飞世尔科技公司 | 3122MTX | |
| VisionMate SR 单机架 2D 条形码读取器 | 赛默飞世尔科技公司 | 3115 | |
| 1-200 μL型通用适配移液器吸头 | 康宁 | 4864 | 无核酸酶 |
| Cellstar 细胞培养皿 | Greiner Bio-One | 628160 | 无核酸酶 |
| Greiner Bio-One 96孔聚苯乙烯Cellstar组织培养板，U型底 | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | 无核酸酶 |
| #4 滤纸 | Whatman，GE Healthcare | 1004 150 | |
| 硅胶球型安全移液管吸头 | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | ND-3300 |
参考文献
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotec....
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