对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。
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摘要
摘要
下一代测序、微阵列和qRT-PCR等技术平台在拓展我们对分子调控广度的理解方面具有巨大潜力。较新的方法，如高分辨率RNA测序（RNA-Seq）1，能够提供有关组织或状态特异性表达的新而广泛的信息，包括相对转录本水平、可变剪接以及微小RNA（micro RNAs）2-4。在特定组织内或表型不同的个体组之间，利用RNA-Seq方法进行比较性全转录组分析5，为揭示正常与异常生理状态下所涉及的分子机制提供了新的途径。最近，已在人类脑组织上开展了全转录组分析，鉴定了与疾病进展相关的基因表达差异6。然而，下一代测序技术在哺乳动物研究中的广泛应用仍有待进一步推进。
在小鼠模型中的基因表达研究已利用激光捕获显微切割技术（LCM）对不同脑核团进行样本分离，并报道了各自独特的表达谱7,8。尽管LCM能够以单细胞和特定脑区的精度进行样本采集，但该方法从小鼠脑组织中获得的总RNA产量相对较低，可能限制其在RNA测序及其他表达谱分析中的应用，并可能需要采用次优的样本扩增步骤。本文介绍了一种从小鼠特定脑区进行显微解剖及提取总RNA的实验方案。采用固定直径的组织打孔器，从单个小鼠脑组织连续冠状切片（厚度750 μm）中分离出13个脑区组织。显微打孔所得组织样本立即冷冻并存档。利用磁珠介导的总RNA分离技术从小份样本中提取总RNA。所获得的RNA样本在产量和质量上均满足后续表达谱分析的要求。该显微解剖策略为现有样本采集方法提供了一种可行替代方案，有助于从小鼠特定脑区获取总RNA，为新的基因表达发现提供了可能。
方案
1. 采样装置与准备
- 在 Earle 平衡盐溶液（EBSS）中添加碳酸氢钠（每 100 mL EBSS 加 0.44 g）和葡萄糖（每 100 mL EBSS 加 0.884 g）9。将 EBSS 加入焦碳酸二乙酯（DEPC）（每 100 mL EBSS 加 0.1 mL），置于带螺旋盖的可高压灭菌瓶或烧瓶中，37 °C 处理至少 12 小时。
- 将 5¾ 英寸玻璃巴斯德吸管放入 1000 mL 玻璃烧杯中，将画笔毛刷端朝上放入 100 mL 玻璃量筒中。分别加入足量 DEPC 溶液（每 100 mL ddH2O 加 0.1 mL）以浸没吸管和毛刷。用铝箔覆盖烧杯和量筒，37 °C 孵育至少 12 小时。
- DEPC 处理 12 小时后，将所有经 DEPC 处理的材料加热至温度 >100 °C，持续至少 15 分钟。取出 EBSS 并冷却至室温，随后于 4 °C 保存。将 ddH2O 从烧杯和量筒中倾倒出去，继续在 >100 °C 下孵育直至材料完全干燥。取出后冷却至室温，储存备用。
- 实验当天，使用 RNaseZap 处理所有工作台面。
- 将 EBSS 置于 40 °C 水浴中保温。为缓冲并氧合 EBSS，通过将气体管路插入无 RNase 的巴斯德吸管，并将该吸管插入 EBSS 中，通入 95%/5% O2/CO2 混合气体。覆盖 EBSS 容器开口。
- 设置 Stoelting 组织切片机用于脑组织连续切片。用 RNaseZap 处理切片机的顶面和底面。将一片矩形 Whatman #4 滤纸固定在切片机的有机玻璃表面上。将双刃剃刀片安装至切片臂上。将千分尺归零，并调节切片臂的最低高度，使刀片可切割滤纸但不损伤有机玻璃板。
- 准备显微解剖所需的所有其他材料，包括无 RNase 的 60×15 mm 细胞培养皿、Harris Uni-Core 组织打孔器、用于连接气体管路以在冠状脑切片显微取样过程中氧合 EBSS 的 200 μL 无 RNase 微量移液器吸头、弯头剪刀、干冰以及组织收集管。将收集管置于干冰上。
2. 脑组织的取出与冠状切片
- 将小鼠放入 DecapiCone 中，使用啮齿类动物断头器进行断头。取出头部并置于平坦的表面上。用手术刀从鼻孔后约 3 mm 处开始沿颅骨中线切开皮肤。向两侧剥离皮瓣，暴露颅骨和眼眶。
- 使用弯头剪刀剪断两侧视神经，切断其与眼球的连接。小心击碎枕骨和顶间骨，并移除背侧的顶骨和额骨，以打开颅腔。使用骨剪剪碎鼻骨和泪骨，暴露嗅球。用弯头剪刀将嗅球从脑前部切下。完整取出脑组织，保留后脑结构。将脑组织放入一个 60 × 15 mm 的无 RNase Cellstar 细胞培养皿上层中，并转移至组织取样操作台。
- 使用无 RNase 的移液器，用 EBSS 小心润湿组织切片机上附着的滤纸。用 EBSS 润湿脑组织表面。
- 将脑组织转移至组织切片机中，并调整至适当方向。注意：脑组织应腹面朝下放置在滤纸上，脑中线（半球间裂）应与切片刀刃垂直，脑前缘应紧贴刀刃。
- 使用经 DEPC 处理的画笔，轻轻按压脑组织背侧以固定其位置。在保持脑组织不动的同时，将刀架杠杆抬高至背侧组织表面以上约 4–5 cm 处，并保持在此位置。将画笔从脑表面移开，调节千分尺至 750 μm，然后释放杠杆，切割组织，获得厚度为 750 μm 的冠状切片。
- 在切片刀保持静止的状态下，使用画笔以滚动方式轻轻将切下的组织切片从刀片表面推开。立即将组织切片放入培养皿中充氧的 EBSS 溶液中。此时第二位研究人员可开始执行步骤 3.1。
- 重复步骤 2.5 和 2.6，直至在整个前-后轴向上获得连续的脑切片。
3. 脑区显微解剖
- 调整光照条件，确保在组织显微解剖过程中样本照明不受阻碍。调节95%/5%的O2/CO2混合气体的位置和流速，以在显微解剖期间为组织维持缓冲且含氧的环境。
- 确定包含目标区域的冠状脑切片。使用画笔将脑切片平整地置于培养皿底部。根据表1或其他参考文献选择合适直径的组织打孔器。用画笔固定冠状组织切片位置的同时，将组织打孔器的切割端垂直下压至组织切片表面。
- 在施加压力的同时，将组织打孔器尖端完全压过组织切片，并牢固压至培养皿底部。采用滚动式环形运动，确保目标区域已与周围组织分离。小心将组织打孔器从组织切片上提起，释放出微小组织柱，使其漂浮于EBSS中。
- 使用画笔立即将组织微小柱转移至置于干冰上的-80°C稳定储存管中。组织应迅速附着于管壁。将含有微小样本的储存管放回干冰中。
- 对每个目标脑区重复步骤3.2至3.4。
4. 组织存档
- 微切割完成后，使用 VisionMate 扫描系统记录每个含有样本的 TrakMates 管对应的条形码。当 96 孔 TrakMates 管架填满后，立即扫描管架，并迅速将组织样本放入 -80 °C 超低温冰箱中，直至进行 RNA 提取。
5. 总RNA提取
- 使用 RNaseZap 准备无 RNase 的工作环境。按照 MagMAX-96 总 RNA 分离方案10中的说明，准备足量的磁珠混合液和裂解/结合溶液。
- 从 -80 °C 冰箱中取出组织样本，并将试管直接置于干冰上。
- 向含有样本的 TrakMates 管中加入 100 μL 裂解/结合溶液。将无核酸酶的 0.5 ml 管规格研磨杵连接到沉淀混合器上，匀浆组织。使用低吸附无核酸酶移液吸头，将匀浆后的样本转移至圆底 96 孔细胞培养板的一个孔中。立即使用低吸附无核酸酶移液吸头向样本中加入 60 μL 100% 异丙醇，并上下吹吸 3–4 次以混匀。
- 使用低吸附无核酸酶移液吸头向样本中加入 20 μL 磁珠混合液。上下吹吸 3–4 次以混匀。
- 对所有组织样本重复步骤 5.3–5.4。
- 从 III.A.2 步骤开始，按照 MagMAX-96 总 RNA 分离方案完成总 RNA 提取。注意： 市面上可提供其他基于磁珠的总 RNA 分离试剂盒；但本研究未对其进行评估。请参考各生产厂家试剂盒说明书，了解使用相应产品进行总 RNA 分离的具体操作。
- 使用 NanoDrop 3300 分光光度计或其他微量分光光度计/荧光计技术测定所得总 RNA 的纯度和浓度。
6. 代表性结果：
| 脑区/核团 | 组织取样器直径 (mm) | 总RNA (ng/μL) | 260/280 比值 |
| 额叶皮层 | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| 伏隔核 | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| 纹状体 | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| 扣带皮层 | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| 下丘脑 - 室旁核 / 视交叉上核 (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| 丘脑 | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| 下丘脑 - 背内侧核 / 腹内侧核 (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| 杏仁核 | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| 海马 - CA2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| 海马 - CA1/齿状回 | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| 导水管周围灰质 | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| 背缝核 | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| 网状结构 | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
表1. 小鼠脑区显微解剖样本及其相应的最佳组织打孔器直径、代表性总RNA得率与纯度。所列13个显微解剖脑区按头尾方向排序，其大小与空间取向各异。PVN/SCN微切割样本包含位于前内侧的室旁核、部分室周核、下室周区及其他小细胞神经元。丘脑微切割样本包含位于与PVN/SCN微切割区域同一冠状面的前丘脑核团。DMH/VMH微切割样本包含位于背内侧核与腹内侧核之间的附属大细胞核团及其他小细胞神经元。杏仁核样本包含中央核与基底外侧亚区。RNA得率及260/280比值为各脑区显微解剖样本中单次测定结果，用以展示各脑区所得读数。
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讨论
本方案中有多个关键步骤需要仔细关注和考虑。首先，必须确定合适的组织钻孔器直径，以切除各自的目标区域。尽管表 1 中列出的组织钻孔器直径适用于所列脑区的取材，但每位研究者仍应根据自身感兴趣组织的最佳取材需求，确定合适的钻孔器尺寸。其次，本方法中报告的冠状切片厚度（750 μm）是经实验确定，在不同遗传背景的成年小鼠中均能最佳地识别目标脑区（表 1）。神经解剖学标志用于确认各目标区域的边界，这些标志在不同个体动物之间无差异。切片厚度可以调整；然而，若选择低于 500 μm 的切片厚度，将带来技术上的挑战，从而影响本显微解剖方法的有效性。最后，从动物断头至完成脑切片的最适时间应控制在 5 分钟内。在此时限结束前，所有冠状脑切片均应已置于充氧的 EBSS 培养基中。
采用磁珠技术进行总RNA分离可避免基于离心柱的RNA提取方法，显著缩短样本制备此阶段所需时间。此外，磁珠技术使实验方案具有可扩展性；高通量总RNA分离可使用市售的磁性颗粒处理系统。总之，本文所述的显微切割方法是一种易于实施、成本效益高且可扩展的实验方案，适用于多种研究领域，可用于利用新一代测序...
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致谢
本工作由美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA）和陆军研究办公室（Army Research Office, ARO）资助，资助编号为 W911NF-10-1-006。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 水浴锅 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| 实验室旋转仪（轨道摇床） | 赛默飞世尔科技公司 | 2314 –- 1CEQ | |
| 颗粒混合器 | VWR 国际公司 | 47747-370 | |
| 无RNase 0.5 mL研磨杵 | VWR国际 | KT749521-0590 | 无核酸酶 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| 双面剃须刀片 | 斯托尔丁公司 | 51427 | |
| St–手动千分尺组织切片机 | Stoelting 公司 | 51425 | |
| 2/0号圆头画笔艺术家’s刷子 | 普林斯顿艺术刷 | 4350R | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔仪（0.75 mm） | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔仪（1.0 mm） | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔器（1.5 mm） | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core 组织穿孔器（2.0 mm） | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| 断头台 | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | 赛默飞世尔科技公司 | SH30029.02 | |
| 25 mL 移液管 | Corning | 4489 | 无核酸酶 |
| epT.I.P.S. LoRetention 双滤芯吸头，20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| TrakMates 带盖螺口管 | 赛默飞世尔科技公司 | 3741 | |
| VisionMate 无线 2D 条形码阅读器 | 赛默飞世尔科技公司 | 3122MTX | |
| VisionMate SR 单机架 2D 条形码读取器 | 赛默飞世尔科技公司 | 3115 | |
| 1-200 μL型通用适配移液器吸头 | 康宁 | 4864 | 无核酸酶 |
| Cellstar 细胞培养皿 | Greiner Bio-One | 628160 | 无核酸酶 |
| Greiner Bio-One 96孔聚苯乙烯Cellstar组织培养板，U型底 | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | 无核酸酶 |
| #4 滤纸 | Whatman，GE Healthcare | 1004 150 | |
| 硅胶球型安全移液管吸头 | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | ND-3300 |
参考文献
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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