本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。
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成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例
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摘要
摘要
许多真核细胞能够感知其环境中化学信号的浓度梯度，并随之定向迁移 1这种由化学信号引导的细胞迁移被称为趋化性，对于多种细胞执行其功能至关重要，例如免疫细胞的迁移和神经元细胞的模式形成。 2, 3一大类G蛋白偶联受体（GPCRs）可识别多种小分子肽（称为趋化因子），从而调控细胞迁移 体内 4趋化性研究的最终目标是阐明GPCR机制如何感知趋化因子梯度，并调控引发细胞趋化的信号事件。为此，我们采用成像技术实时监测趋化剂在时空上的浓度分布、细胞在趋化剂梯度中的运动行为、GPCR介导的异源三聚体G蛋白的活化，以及真核细胞趋化过程中涉及的细胞内信号事件 5-8简单的真核生物， 盘基网柄菌表现出与白细胞相似的趋化行为， D. discoideum 是研究真核生物趋化性的关键模式系统。作为自由生活的变形虫， D. discoideum 细胞在营养丰富的培养基中分裂。当处于饥饿状态时，细胞进入发育程序，通过cAMP介导的趋化作用聚集，形成多细胞结构。许多参与cAMP趋化的组分已被鉴定出来 D. discoideumcAMP 与 GPCR（cAR1）结合后，可诱导异源三聚体 G 蛋白解离为 Gα 和 Gβγ 亚基 7, 9, 10Gβγ亚基激活Ras，后者进而激活PI3K，将PIP2 进入 PIP3 在细胞膜上 11-13磷酸肌醇磷酸酯3 作为含有pleckstrin同源（PH）结构域蛋白的结合位点，从而将这些蛋白招募至细胞膜 14, 15cAR1受体的激活还调控PTEN与细胞膜的结合，PTEN可使PIP去磷酸化3 至 PIP2 16, 17分子机制在人中性粒细胞等细胞由趋化因子GPCR介导的趋化作用中具有进化保守性 18我们介绍了以下用于研究趋化性的方法 D. discoideum 细胞1. 化学趋化组分细胞的制备 2. 在cAMP梯度中对细胞趋化作用进行成像 3. 在单个活细胞中监测GPCR诱导的异源三聚体G蛋白活化 4. 成像化学引诱剂触发的动态PIP3 实时监测单个活细胞的反应。我们开发的成像方法可用于研究人类白细胞的趋化性。
方案
1. 嗜中性粒细胞样细胞Dictyostelium discoideum的感受态细胞制备
- 为了获得对趋化因子cAMP具有趋化性的D. discoideum细胞，从22°C振荡培养的D3-T富集培养基中收获正在生长的细胞。
- 用无营养发育缓冲液（DB缓冲液，含5 mM Na2HPO4、5 mM KH2PO4、2 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2）将细胞洗涤两次。
- 将细胞重悬于DB缓冲液中，密度为2×107个细胞/ml。
- 将10 ml细胞悬液置于250 ml锥形瓶中，在22°C、100 rpm条件下振荡培养1小时。
- 在6小时内每隔6分钟向10 ml细胞悬液中加入100 μl的7.5 μM cAMP储备液，使最终cAMP浓度达到75 nM，此过程称为cAMP脉冲处理。经过5–6小时的cAMP脉冲处理后，D. discoideum细胞即具备对cAMP浓度梯度的趋化能力。
- 以200 g离心5分钟收集细胞，然后用含有2.5 mM咖啡因的DB缓冲液重悬细胞，并在22°C、200 rpm条件下振荡培养20分钟，使细胞处于趋化反应的准备状态。
2. 在可见且可操控的趋化因子梯度中对趋化细胞进行成像
- 用新配制的30 μl含1 μM cAMP和0.1 μg/μl Alexa 594的DB缓冲液溶液回填微量移液管。
- 将Femtotip连接至微量移液管固定器，并将管路连接至压力供给装置——Eppendorf FemtoJet系统。
- 将微量移液管组件安装到微操作器（Eppendorf TransferMan NK2）的电动微操作器上，以提供稳定的压力，从而建立稳定的浓度梯度。
- 在共聚焦显微镜的40倍油镜上放置一个装有6 ml DB缓冲液的一孔LabTek培养皿，使用明场光学系统，将Femtotip置于视野中央。
- 打开压力供给装置，设定补偿压力（Pc）为70 hPa，以建立cAMP/Alexa 594混合物的浓度梯度。
- 通过543 nm激光激发，观察所需浓度的cAMP与Alexa 594的荧光信号，从而可视化cAMP浓度梯度。
- 使用微操作器的自动定位功能，将微量移液管移至所需位置，并将其设为位置1、位置2和位置3，以调控细胞所暴露的浓度梯度。
3. 静止的非极化细胞系统有助于成像cAMP梯度感知相关的信号事件
- 咖啡因处理后，取一份细胞样品，在 500g 离心 3 分钟。
- 弃去上清液，用含有 2.5 mM 咖啡因的新鲜 DB 缓冲液将细胞重悬并稀释至 5×105 个细胞/ml。
- 将 1 ml 细胞悬液加入单孔腔室，或每孔加入 0.4 ml 至四孔腔室的各孔中。
- 静置 10 分钟使细胞贴壁，小心吸去缓冲液以去除未贴壁细胞，并补充相同体积的新鲜缓冲液。
- 在显微镜下找到目标细胞，开始成像。
- 对于旨在监测细胞在稳定梯度刺激下信号组分动态变化的实验，应在实验开始前用 5.0 μM（终浓度）Latrunculin B 处理细胞 10 分钟。
4. 同时监测异源三聚体G蛋白活化和PIP3生成
- 通过cAMP脉冲处理共同表达GαCFP和YFPGβ（G细胞）以及表达PIP3指示剂PH-GFP（PH细胞）的发育细胞7。
- 将这两种类型的细胞按1:1比例混合，并接种至单孔或四孔培养皿中。
- 使用Lambda Stack采集模式，在464至624 nm光谱范围内（步长10 nm），创建并保存CFP、YFP和GFP的发射指纹参考曲线。
- 在同一Lambda Stack采集模式下，于464至544 nm光谱范围内（步长10 nm），同时对G细胞中的G蛋白活化和PH细胞中的PIP3生成进行成像。
- 应用蔡司510META软件的线性解混功能，利用已保存的CFP、YFP发射指纹，通过数学方法计算Lambda Stack中每种荧光团的贡献，从而将G细胞中的CFP和YFP信号强度分离至独立通道。
- 采用相同策略，利用已保存的GFP和背景发射指纹，通过线性解混功能数学计算PH细胞中的GFP信号强度。
5. 代表性结果：
- 一个优秀的模型系统 D. discoideum 用于G蛋白偶联受体介导的趋化作用。 一种社会性变形虫， D. discoideum 在其生命周期中表现出显著的趋化性。由于其在遗传学和生物化学方面的优势，D. d 为研究趋化性提供了一个强大的系统。
- 在可见且可操控的化学引诱场中细胞的趋化性 此处，我们首先展示一种简单的方法，通过一系列稀释实验，获得cAMP浓度与荧光染料Alexa 594荧光强度之间的线性关系 2 μM cAMP 与混合 10 μg/mL Alexa 594（图 2A）。接下来，我们提供一种简便的方法来可视化该梯度，并通过 Alexa 594 的荧光强度对梯度中 cAMP 浓度进行定量测量（图 2B）。
- 细胞运动与细胞极化和方向感应相互解偶联。 一种肌动蛋白聚合抑制剂可消除已存在的形态学极性，同时阻止细胞移动，但保留细胞的方向感测能力（图3A）。使用可见光和 可操控的 cAMP 刺激可确保输入信号，例如均匀施加的刺激或浓度梯度。该方法可对 cAMP 诱导的关键信号组分在梯度感知机制中的重新分布进行定量分析。通过测量这些信号组分的时空动态变化，有助于我们理解信号网络如何在均匀刺激下实现适应性响应，同时在梯度刺激下产生极化的生化反应（图 3B）。
- 暴露于稳定梯度下化学感应信号网络动力学的系统性测量 准确测量方向感应信号通路组分的动力学/动力学特征，对于理解各组分在细胞首次暴露于浓度梯度时如何参与建立细胞内极化至关重要。通过应用高时空分辨率的活细胞成像技术，我们首次展示了细胞在稳定cAMP梯度刺激下PIP3的双相生成过程（图4A-C）。利用活细胞成像，我们系统地测定了从cAMP刺激到PIP3生成的方向感应特异性信号网络的动力学变化（图4D、E）。
- 同时监测异源三聚体G蛋白活化与PIP3 在均匀施加的cAMP刺激下的产生情况。 Förster共振能量转移（简称FRET）为监测cAMP刺激下异源三聚体G蛋白的活化（解离）提供了一种高效的方法。本文介绍了一种简便易行的系统，可同时检测异源三聚体G蛋白的活化与PIP3 通过监测 PIP 的 FRET 变化和膜转位来检测其生成3 探针，分别在G细胞和PH细胞中表达PH-GFP（图5）。均匀施加的cAMP刺激可引发持续性的G蛋白激活，而该刺激则引发短暂的PIP3 生产。
图 1：用于 GPCR 介导趋化性的优良模式系统 D. discoideum。A. 示意图显示方向感应的简要信号通路。B. cAMP 梯度诱导 D. discoideum 细胞快速趋化。细胞表达 PIP3 探针 PH-GFP（绿色）。梯度（红色）通过 Alexa 594 可视化。比例尺=50μm。
图 2：在可见且可操控的趋化因子场作用下细胞的趋化性。A. 图表显示了通过将 2 μM cAMP 与 10 μg/mL Alexa 594 混合并进行系列稀释后，cAMP 浓度与荧光染料 Alexa 594 强度之间的线性关系。B. 利用 A 图中 cAMP 浓度与荧光染料 Alexa 594 强度之间的线性关系，对浓度梯度中的 cAMP 浓度进行定量测定。
图3：细胞运动性与细胞极化和方向感应去耦联。A. 图像显示，经肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin B处理后失去运动能力的细胞仍具备方向感应能力。细胞表达PIP3探针PH-GFP（绿色）。化学引物梯度（红色）由Alexa 594标记显示。 B. 可控的cAMP刺激与非运动细胞系统可用于解答方向感应的关键科学问题。比例尺=10μm。
图4：细胞在稳定梯度刺激下化学感应信号网络动力学的系统性测量。 A. 图像拼接显示细胞在稳定cAMP梯度（红色）刺激下产生双相性PIP3（绿色）的过程。 B. 图像显示用于测量PIP3生成动力学的感兴趣区域（ROIs），结果如C图所示。 C. 细胞在稳定梯度刺激下PIP3生成的动力学曲线。 D. 示意图展示从cAMP刺激到PIP3生成的方向感知信号通路网络，其在稳定梯度刺激下的动力学以相同颜色的实线显示于E中。
图5：GPCR信号网络多事件同步监测。A. 示意图展示了同时检测异源三聚体G蛋白活化和PIP3 通过监测PIP3探针PH-GFP在G细胞和PH细胞中FRET变化及膜转位来检测其生成。 B. G蛋白和PH细胞的彩虹图像 montage 显示，均匀施加的cAMP刺激可引发细胞周边持续性的G蛋白活化，而仅引发短暂的PIP3生成。时间点分别为刺激前（0秒）以及刺激后4.9秒、10.2秒和20.4秒。 C. 均匀施加cAMP刺激后G蛋白活化与PIP3生成的动力学
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讨论
细胞达到趋化感受态阶段的过程
对于野生型 D. discoideum 细胞，在室温下通过约 5 ˜ 6 小时的 cAMP 脉冲诱导，可使其进入具有良好趋化能力的阶段，此阶段的细胞表现出明显的极性形态和快速的细胞迁移（图 1）。多个因素，如脉冲所用的 cAMP 浓度、温度以及不同的遗传背景，均可能影响细胞达到趋化能力阶段的过程。cAMP 梯度引导细胞向 cAMP 源方向移动，这种定向的细胞迁移被称为趋化性。然而，由于发育不足或遗传背景原因未能达到趋化能力阶段的细胞，可能不会表现出两个典型特征：极性形态和快速移动能力。另一方面，因过度发育而超过趋化能力阶段的细胞常常聚集成团，难以分离为单个细胞用于成像实验。
1. 在可见且可操控的趋化因子梯度中对趋化细胞进行成像
将荧光标记且可操控的趋化因子刺激应用于实验系统是一项技术进步。传统上，我们采用均一施加的刺激（也称为均匀刺激）或梯度刺激来观察细胞形态和行为。然而，这种“盲式”刺激无法提供刺激物到达细胞的时间-空间信息，因此...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）的院内基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D3-T 培养基 | KD Medical | ||
| 咖啡因 | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT 可编程定时器 | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 蠕动泵 | Gilbson | ||
| 平台式旋转摇床 | |||
| FemtoJet 微毛细管压力供给系统 | Eppendorf | ||
| 单孔和四孔 Lab-Tek II 玻片培养室 | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META 或同等荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 配备 40X 1.3 NA 或 60X 1.4 NA 油镜 DIC Plan-Neofluar 物镜 | |
| Olympus X81 或同等设备 | Olympus Corporation | 需配备 100X 1.47 NA TIRF 物镜 |
参考文献
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