直流电刺激对小鼠脑片诱发癫痫发作的影响

摘要

来源：Lu, H., 等 小鼠脑片制备中癫痫样活动的直流刺激与多电极阵列记录。J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了一项研究，旨在评估直流电刺激（DCS）对小鼠脑片中癫痫发作的影响。将包含连接的内侧丘脑（MT）和前扣带皮层（ACC）区域的脑片放置于多电极阵列（MEA）中。通过对MT施加电刺激并使用致痫药物，在ACC中诱发癫痫发作。随后施加DCS，以评估其对诱发性癫痫发作的影响。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 多电极阵列记录实验溶液与设备的准备

1. 制备人工脑脊液（人工脑脊液 [aCSF]；含 124 mM NaCl、4.4 mM KCl、1 mM NaH₂PO₃、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、25 mM NaHCO₃ 和 10 mM 葡萄糖，用 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体持续通气）。
2. 使用两种类型的多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA 和 8 × 8 MEA。前一种探针覆盖包含皮层、纹状体和丘脑的区域；后一种探针仅覆盖皮层区域。
3. 使用具有 0.1 Hz 至 3 kHz 带通滤波器的 60 通道放大器，放大倍数设为 1,200 倍。以 10 kHz 的采样率采集数据。
4. 在 MEA 腔室内放置两根镀有氯化银的银丝，用于弥散性皮层刺激（DCS）。使用这些镀氯化银的银丝，通过隔离刺激器产生电场。
5. 插入一根钨电极（直径 127 µm，长度 7.62 cm，8° 交流锥形尖端，电阻 5 MΩ）用于丘脑刺激，并将参考电极置于 MEA 腔室内。通过由脉冲发生器控制的隔离刺激器输送钨电极的电流。

2. 脑切片制备

1. 使用4-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。将动物饲养在空调房间内（21-23 °C；50%湿度；12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为上午8:00），自由摄食和饮水。
2. 取步骤1.1中配制的250 ml aCSF分装液，置于盛有冰块的烧杯中。同时，持续通入由95% O₂ 和5% CO₂组成的混合气体。
3. 手术
   1. 将小鼠置于玻璃麻醉盒中，用4%异氟烷麻醉约3分钟。当动物达到手术麻醉深度（表现为对脚趾夹捏无反应）时，将其放置在装有碎冰的浅盘上，用剪刀迅速断头。
   2. 暴露颅骨，剪除残留的肌肉组织。接着使用咬骨钳剥离脑组织背侧的颅骨，再用咬骨钳修剪颅骨两侧。所有手术器械均用75%乙醇溶液进行消毒。
   3. 使用刮铲沿脑腹侧切断嗅球及神经连接，取出脑组织。断头后，迅速将脑组织转移至盛有冰冻含氧aCSF的烧杯中。
4. MT-ACC脑片制备
   注意：制备包含从MT至ACC通路的脑片。
   1. 用手持刀片对脑组织进行修块，于中线两侧每侧2.0 mm处做矢状切口，以暴露皮层下解剖结构。然后进行两次斜切：第一次横切平行于纹状体内可见的纤维束。
   2. 第二次横切从小脑与视觉皮层之间的连接处，延伸至前连合与视束之间腹侧中点，该切面应与丘脑扣带回通路平行。
   3. 用氰基丙烯酸盐胶水将脑组织块固定在角度板（约120°）上，在通路转折点稍上方进行一次切割。展开角度板并将其展平，再粘附至振动切片机的切片室载物台上。
   4. 制备内侧丘脑-ACC脑片（厚度500 µm），随后将其浸入冰冻含氧aCSF中。将脑片转移至记录室，在持续灌流（12 ml/min）含氧aCSF的条件下，于32 °C孵育1小时。

3. 多电极阵列记录用灌流室的制备

1. 灌流室的准备
   1. 将MEA探针放置在多通道系统上，并使用两条独立的聚乙烯管将探针连接至蠕动泵。其中一条管用于将aCSF导入MEA室，另一条管用于将aCSF导出。最后，以温暖（29–30 °C）且充氧的aCSF持续灌流样本（8 mL/min）。
2. 将脑切片转移至MEA。使用湿润的棉签固定脑切片，并小心移动切片，确保前扣带皮层（ACC）位于电极上方。
3. 使用切片固定套件和压片装置压紧脑切片，以确保切片与电极之间形成良好的电接触。

4. 通过直流电刺激产生电场

注意：电场方向的定义基于前扣带皮层（ACC）中轴树突轴的方向。树突和胞体区室的方向通过高尔基染色法确认。

1. 将 AgCl 电极（定义为阳极）置于靠近 ACC 的位置，将另一电极（定义为阴极）置于远离 ACC 的位置。通过微电极阵列（MEA）记录由两种电场方向（平行和垂直于 ACC 轴突-树突纤维）产生的场强，并使用刺激器施加电场电流。
2. 固定 AgCl 电极之间的距离（约 1.5–2 cm），并调节刺激器的电流强度，使直流电刺激（DCS）电流介于 0.5 至 2 mA 之间。

5. 电刺激诱导的皮层突触反应

注意：通过在 MT 进行电刺激以诱导 ACC 的突触反应，其中可编程电刺激发生器产生矩形双相电流脉冲。

1. 重复上述第 3 节步骤。
2. 将钨电极置于丘脑（MT）中，通过双极钨电极将刺激器的脉冲传递至脑片的丘脑区域。
3. 使用不同强度的电流以确定引发前扣带皮层（ACC）反应的阈值。此处采用 ±150 µA 的电流强度和 200 µsec 的持续时间，该参数在多数脑片中可引发 ACC 80% 的最大反应。
4. 沿丘脑-扣带通路（从 MT 至胼胝体）移动钨电极，在 MT-ACC 脑片中获取最佳反应曲线。
5. 记录 10–20 次 ACC 反应的扫描结果，并使用软件自动对所有由 MT 刺激引发的 ACC 反应进行平均。所得结果即为通过 MT-ACC 通路刺激诱发的 ACC 突触反应。

6. 电诱导的癫痫样活动

注意：通过应用4-氨基吡啶（4-AP；250 µM）和荷包牡丹碱（5 µM）诱导出类似癫痫发作的活动。既往的时间对照研究表明，药物应用后2-3小时出现最大且稳定的反应。

1. 重复上述第5节操作。
2. 向灌流液中加入药物，使用4-AP（250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline，5 µM）。将药物充分混匀后，继续灌流2–3小时。
3. 为促进类似癫痫样活动的产生，保持灌流泵在相对较快的流速（8 ml/min），这也有助于防止pH梯度的形成。
4. 将钨电极置于MT区域，并施加电刺激（150 µA，持续时间200 µsec），以获取ACC反应谱型。
5. 进行10–20次扫描，并对所得反应进行平均处理。
6. 用新鲜的aCSF替换灌流液，以洗脱药物。重复步骤6.5。

7. 测试DCS对诱发皮层反应的影响

1. 重复第3和第4节操作。确保通过置于MEA室内的两根平行的AgCl镀银导线之间传递电流，以产生均匀的电场。若无异常，直流电刺激（DCS）电流应维持在0.5至2 mA之间。
2. 关闭直流电刺激（DCS），使用钨电极刺激丘脑（±150 µA，持续时间200 µsec）。为获得前扣带皮层（ACC）的最大突触反应，进行10-20次扫描并取反应的平均值。
3. 同时开启直流电刺激（DCS强度为2 mV/mm）和丘脑刺激（350 µA，持续时间200 µsec）。评估在直流电刺激期间，丘脑刺激诱发的ACC反应幅度的变化。
4. 关闭直流电刺激（DCS），并向灌流液中加入4-AP（250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline，5 µM）。随后等待2-3小时。当药物作用于脑片时，脑片将产生皮层癫痫样放电反应。
5. 进行10-20次ACC反应扫描，测量电刺激诱发的皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间。
6. 在步骤7.5之后，同时开启直流电刺激（DCS强度为2 mV/mm）和丘脑刺激（150 µA，持续时间200 µsec）。评估在应用直流电刺激期间，诱发的皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间的变化。
7. 更换为新鲜的aCSF灌流液，以洗脱药物，并重复步骤7.2和7.3。
8. 收集所有记录数据，并按不同实验条件分组。评估在不同实验条件下皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉剂：
异氟烷	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
人工脑脊液（aCSF，总量：1 L）：
D(+)-葡萄糖	MERCK	1.08337.1000	10 mM
碳酸氢钠	MERCK	1.06329.0500	25 mM
氯化钠	MERCK	1.06404.1000	124 mM
(+)-L-抗坏血酸钠，>=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
无水硫酸镁，ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
二水氯化钙	MERCK	1.02382.1000	2 mM
一水磷酸二氢钠	MERCK	1.06346.1000	1 mM
氯化钾	May & Baker LTD Dagenham England	MS 7616	4.4 mM
药物：
(+)-荷包牡丹碱	TOCRIS	130	5 µM in aCSF
4-氨基吡啶	TOCRIS	940	250 µM in aCSF
脑片制备：
振动切片机	Vibratome	Series 1000	将组织块切成 500 µm 厚的切片
多电极阵列（MEA）系统：
多电极阵列（MEA）探针：6 x 10 平面 MEA	Multi Channel Systems	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	电极直径 30 µm；电极间距 500 µm；阻抗 50 kΩ（200 Hz 时）
多电极阵列（MEA）探针：8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	锥体形电极；直径 40 µm；尖端高度 50 µm；电极间距 200 µm；阻抗 1,000 kΩ（200 Hz 时）
使用60通道放大器，带通滤波器设置为0.1 Hz至3 KHz，放大倍数为1,200倍	Multi Channel Systems	MEA-1060-BC
MC Rack 软件，采样率为 10 KHz	Multi-Channel Systems		用于数据采集和记录的软件
脉冲发生器控制	Multi-Channel Systems	STG 1002
脑片固定套件及压片装置	Warner Instruments	SHD-26H/10; WI64-0250
蠕动泵-minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	灌流速率：8 ml/min
刺激系统：
隔离式刺激器	A-M Systems	Model 2100	刺激强度 ±350 μA，持续时间 200 μsec
钨电极	A-M Systems	575300	置于丘脑