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一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

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DOI：

10.3791/3130

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2011年7月22日

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1Department of Population Health, University of Georgia

本文内容

摘要

我们描述了一种多重PCR方法，用于快速检测肠道沙门菌（Salmonella enterica）的肠炎血清型（Enteritidis）、哈达尔血清型（Hadar）、海德堡血清型（Heidelberg）和鼠伤寒血清型（Typhimurium）。通过针对特定血清型O-抗原生物合成基因簇及鞭毛蛋白基因中独特基因和序列的多重PCR，可鉴定特定的沙门菌血清型。随后，根据出现的特异性扩增片段（PCR产物）大小，对应于目标等位基因，即可将血清型分配给相应的沙门菌分离株。

摘要

目前商业化的PCR检测通过靶向该属特有的基因来鉴定Salmonella。然而，Salmonella包含两个物种、六个亚种以及超过2500种不同的血清型，它们在公共卫生意义上的重要性并不相同。例如，在商品蛋鸡场检出S. enterica亚种IIIa亚型Arizona的公共卫生意义，远不及检出S. enterica亚种I血清型Enteritidis，后者是与食用商品鸡蛋相关的沙门菌病的主要病因。血清型的鉴定依据是脂多糖（LPS）（O抗原）和鞭毛蛋白（H1和H2抗原）的抗原差异。这些抗原差异正是与该表型相关的基因及其等位基因多样性的外在表现。

我们开发了一种基于四种主要类型之间遗传差异的等位基因分型多重PCR S. enterica 亚种I血清型，常见于家禽，并与美国严重的人类疾病相关。PCR引物对针对特定亚种独有的关键基因或序列 沙门氏菌 血清型，并设计为扩增出针对该基因或等位基因的特异性大小的扩增片段。 沙门氏菌 根据特定LPS和鞭毛蛋白基因等位基因的PCR检测结果组合，为分离株指定血清型。本文所述的多重PCR专门用于检测 S. enterica 血清型I亚种：肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌。

本文演示如何使用多重 PCR 鉴定沙门菌（Salmonella）分离株的血清型。

方案

1. PCR 模板的制备

注意： 为了尽量减少PCR产物的交叉污染，必须将PCR过程中的几个关键步骤在物理空间上相互分开：1）模板（DNA）制备，2）PCR反应体系的建立，3）凝胶电泳。同时建议使用带滤芯的吸头，以防止培养物或试剂对移液器造成污染。

  1. 从单个分离菌落接种1 ml LB肉汤或其他复杂培养基（如脑心浸液肉汤、Superbroth等）培养沙门氏菌（Salmonella）分离株，于37°C过夜培养。
  2. 取1 ml菌液转移至无菌的1.5 ml微量离心管中，在4,500 ×g条件下离心约2分钟，使细菌细胞形成沉淀。
  3. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于1 ml 100%乙醇中，室温静置10分钟。再次以4,500 ×g离心2分钟收集菌体，弃去上清液后将菌体重悬于1 ml PBS中。
  4. 离心收集菌体（4,500 ×g，2分钟），弃去上清液，将菌体重悬于1 ml无菌dH2O中。
  5. 将最终的菌悬液用dH2O按1/20比例稀释（5 μl菌悬液加入95 μl dH2O），并于-20°C保存。全细胞作为PCR模板在-20°C下的保存期限约为一个月。

2. PCR 体系构建

注意：PCR反应体系（模板、缓冲液、寡核苷酸引物、核苷酸和Taq DNA聚合酶）的配制与分装必须在物理上独立的专用空间内进行，最好在PCR/UV工作站中操作。

注意： PCR 准备室必须是独立的，配备专用的 -20°C 冰箱，用于储存 PCR 试剂（缓冲液、寡核苷酸引物和核苷酸）、酶和模板，以及专用的移液器组（用于 PCR 体系配置）、一次性乳胶手套、实验服、带滤芯吸头、微孔板、玻璃毛细管、微量离心管和 10% 漂白剂（用于表面去污染）。使用专用的移液器组（P10、P100 和 P1000）分配 PCR 试剂。该套移液器严禁带离配置工作站。

注意：使用分子生物学级或PCR级的dH2O，并将其分装为每管1 ml至1.5 ml离心管中。每次使用后应重新分装dH2O，以避免可能的交叉污染。其他PCR试剂也建议采用类似的操作方法。

注意：使用前需用紫外光照射和/或用10%漂白剂擦拭表面，对工作区域进行去污染。进行PCR体系构建时，应穿戴实验服和乳胶手套。尽量减少在PCR体系构建区域与PCR反应扩增（使用PCR仪）及PCR产物（扩增子）琼脂糖凝胶电泳分离区域之间的往返走动。若需返回PCR体系构建区域，应丢弃当前佩戴的乳胶手套，并更换一副新手套。

  1. 在 dH₂O 中配制引物母液2o 至浓度为 5×10-4 M. 将引物用dH₂O稀释至1/202O（5 μl/95 μl dH₂O）2o；25 μM）。每种鞭毛蛋白分型引物的寡核苷酸序列见表1。
  2. 从-20°C冰箱中取出PCR试剂和模板，将试剂和样品置于冰上解冻。Taq DNA聚合酶在使用前保持在冰箱中。
  3. 按照表1所述分配用于等位基因分型PCR反应混合物的试剂。
  4. 将9μl PCR反应混合液加入无菌的96孔聚苯乙烯圆底微孔板中的10个孔内，从每列顶部孔（例如A1）开始，沿列向下依次加入，然后进入下一列顶部孔。
  5. 加入1 μl的dH₂O2将9 μl PCR混合液（无DNA对照）加入第一孔（A1），向第二孔中的9 μl PCR混合液分别加入0.5 μl阳性对照模板（i/g,m分型引物对应鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌；r/z10分型引物对应海德堡沙门菌和哈达尔沙门菌；1,2/e,n,x分型引物对应鼠伤寒沙门菌和哈达尔沙门菌）nd 孔（B1），以及1 μl 大肠杆菌 将K12 DH5α加入第三孔（C1）中的9 ml PCR混合液中。
  6. 对于每个额外的孔（D1-H1；A2，B2），向9 μl PCR反应混合液中加入1 μl解冻的样本模板。对于i/g、m等位基因分型PCR， 肠道沙门菌血清型 鼠伤寒沙门菌（i）和肠炎沙门菌（g，m）作为阳性对照， 沙门菌血清型 海德堡（r）和哈达尔（z10）是 r/z 的阳性对照10 多重PCR分型
  7. 将10 μl容量的玻璃毛细管放入Idaho Technology Rapidcycler（8）指定的支架中。
  8. 固定于 holder 后，通过将玻璃毛细管接触微量滴定板底部的孔，向每根毛细管中加入 PCR 反应混合液。倾斜 holder，使液体沿管壁下行，在毛细管两端与 PCR 混合液之间留出空间，随后用丁烷喷灯对玻璃管进行热封，密封毛细管两端。
  9. 将毛细管和支架放入Idaho Technology Rapidcycler中，并根据表1中针对不同等位基因分型引物描述的程序运行PCR。
  10. 当热循环程序完成后，进行凝胶电泳步骤。

3. 凝胶电泳

注意：穿戴专用于电泳实验室的实验服和一副新的 disposable 乳胶手套。

注意：操作溴化乙锭（尤其是琼脂糖凝胶）时，务必佩戴防紫外线护目镜或面罩，并始终戴手套。

  1. 通过将琼脂糖悬浮液放入微波炉中，以20%的功率每次加热2-5分钟，并定期目视检查，反复加热，制备100 ml熔融的1.5%（w/v）分子生物学级琼脂糖溶于1×TAE（或1×TBE）电泳缓冲液（7）。将熔融琼脂糖置于60°C水浴中，直至其温度与水浴温度平衡。
  2. 在倒入熔融琼脂糖前，安装好带有梳子的凝胶模具。选择具有足够齿数的凝胶梳，以产生足够的加样孔用于对照、样品以及至少3个分子量标准品，标准品应放置在琼脂糖凝胶的两端和中间位置。
  3. 向100 ml熔融的1.5%（w/v）琼脂糖（溶于1×TAE或TBE）中加入2 μl溴化乙锭（10 mg/ml），轻轻旋转瓶身混匀，避免产生气泡，然后将瓶内液体缓慢倒入15 cm × 10 cm琼脂糖凝胶模具中央。使用滤纸或纸巾边缘去除琼脂糖凝胶中的任何气泡。
  4. 让凝胶模具在室温下静置，直至琼脂糖完全凝固（约30-45分钟）。将带有凝胶和梳子的凝胶托盘转移至装有1×TAE（或1×TBE）电泳缓冲液的水平浸没式电泳槽中。轻轻从琼脂糖凝胶中拔出梳子。
  5. 检查凝胶托盘相对于电泳槽阴极或正极端的位置，确保该电极位于凝胶底部。注意：请记住带负电荷的DNA向阳极迁移（即“红端跑”）。
  6. 将200 μl DNA分子量标记物（0.25 μg/μl）与40 μl 6× DNA上样染料预先混合。取4.8 μl预混的DNA分子量标记物XIV，分别加入第一、中间和最后一个加样孔中。
  7. 从第2孔开始，由左至右依次加载各PCR样品。避免将样品加入含有分子量标准品的加样孔中。
  8. 加载玻璃毛细管中所含样品的操作步骤如下：
    1. 从 holder 中取出每根毛细管，并用玻璃切割器在毛细管两端做刻痕。
    2. 用双手拇指和食指分别捏住玻璃切割器标记处两侧，折断毛细管。
    3. 将毛细管加样器置于PCR反应混合物相反的一端，缓慢顺时针旋转活塞，使液体移至管底最末端。
    4. 将毛细管插入待加样的孔中，缓慢顺时针旋转活塞，将含Ficoll的样品注入琼脂糖加样孔。操作时注意不要用毛细管刺穿孔壁，或在液体完全排出后继续过度旋转而引入气泡。
  9. 所有样品和标准品加载完毕后，将电源调至恒定电压90 V（即9伏/厘米琼脂糖凝胶）。
  10. 当黄色染料（Taurazine）前沿迁移至凝胶底部1 cm处时，停止电泳。
  11. 电泳完成后，将凝胶转移至紫外透射仪上观察DNA片段和分子量标准品。使用配备橙色玻璃滤光片的宝丽来相机（设置：2×，4.5y）在宝丽来胶片上拍摄图像，或使用CCD相机获取数字图像，并用热敏打印机打印图像。
  12. 将毛细管架放入10%次氯酸钠溶液中浸泡15-30分钟。用dH2O冲洗3次，然后放回PCR准备室晾干。

4. 代表性多重 PCR 结果

等位基因分型PCR结果 沙门氏菌 图1（第3-12泳道）显示了1-10号分离株，并按如下方式解读。O等位基因的命名赋予 沙门氏菌 根据扩增子（PCR产物）大小与PCR对照及所用O等位基因引物组预期大小相匹配的原则进行鉴定：B-560 bp，C1-340 bp，C2-400 bp，D1-620 bp，E1-280 bp。对于使用O等位基因分型PCR检测的菌株（图1A），我们将O等位基因B（泳道10-13）、C1（泳道7-9）、C2（泳道4、5）、D1（泳道3）和E1（泳道6）分配给这十个菌株 沙门氏菌 3-12 泳道中测试的分离株。这些相同的 沙门氏菌 分离株按照图1A的相同顺序，对H1等位基因i；g,m；r；和z10进行了检测（图1B、C）。每个分离株的H1等位基因根据扩增产物是否与PCR对照大小一致，并符合所用4种H1等位基因引物组预期的大小来确定（3）：i-510 bp（图1B，第2泳道）；g,m-310 bp（图1B，第2泳道）；r-170 bp（图1C，第2泳道）；z10-360 bp（图1C，第2泳道）。H1等位基因被归入十种之一 沙门氏菌 分离株：i - 分离株3和8（图1B，泳道5 & 10）；g、m- 分离株1和5（图1B，泳道3） & 7），以及分离株6和9（图1C，泳道8） & 11）；以及 z10 对分离株 2、7 和 10（图 1C，泳道 4、9、 &12). 沙门氏菌 4号分离株在所检测的四种H1等位基因中均为阴性。最后， 沙门氏菌 通过PCR检测分离株中与1,2;1,5;1,6;1,7抗原复合物及e,n,x;e,n,z15抗原复合物相关的H2等位基因。针对H2 1,2;1,5;1,6;1,7复合物和H2 e,n,x;e,n,z15复合物的引物组分别产生290 bp和150 bp的扩增片段（3）。这些引物组无法区分任一H2抗原复合物内的特定H2等位基因，因此不能为分离株确定明确的等位基因类型，例如1,2（3）。 沙门氏菌 分离株4、6、8-10对与H2 1,2；1,5；1,6；1,7抗原复合物相关的H2等位基因呈阳性，而分离株2和7对与e,n,x；e,n,z15抗原复合物相关的H2等位基因呈阳性（数据未显示）。然而 沙门氏菌 分离株1、3和5的两种H2抗原复合物检测结果为阴性，而仅分离株1和5的H2鞭毛蛋白检测结果为阴性，该结果由通用H2鞭毛蛋白PCR（1）测定（数据未显示）。这些结果连同推定鉴定结果一并总结于表2中。 沙门菌血清型 分配给每个分离株。

琼脂糖凝胶电泳；DNA条带模式分析；显示分子量标记的泳道。
图1. 多重PCR用于鉴定与S. enterica血清型Enteritidis、Hadar、Heidelberg和Typhimurium相关的特异性O和H等位基因。 （A）O等位基因多重PCR。（B,C）用于鉴定鞭毛蛋白等位基因i/g,m（B）和r/z10（C）的H1等位基因多重PCR。泳道1和13：100 bp DNA ladder（Promega；Madison, WI）；泳道2：O等位基因B、C1、C2、D1和E（A），H1等位基因i/g,m（B），以及H1等位基因r/z10（C）的多重PCR对照；泳道3-12：Salmonella分离株1-10（表2）。

PCR主混合液热循环仪（Rapidcycler）
试剂组成/浓度用量 参数预期大小
H1 i/g,m     
dH2O 63 μl程序 194°C 1分钟 
10X PCR 缓冲液20 mM MgCl210 μl程序 294°C 1秒 
 500 mM Tris pH8  55°C 1秒 
 2.5 mg/ml BSA  72°C 20秒 
 5% Ficoll 400  40个循环 
 10 mM Tartrazine  斜率 = 2.0 
引物 i (f)*AACGAAATCAACAACAACCTGC2 μl程序 372°C 4分钟510 bp
引物 i (r)*TAGCCATCTTTACCAGTTCCC2 μl   
引物 g,m (f)*GCAGCAGCACCGGATAAAG2 μl  310 bp
引物 g,m (r)*CATTAACATCCGTCGCGCTAG2 μl   
DMSO 5 μl   
dNTP10 mM2 μl   
Taq5 units/μl2 μl   
  90 μl   
H1 r/z10     
dH2O 55 μl程序 194°C 1分钟 
10X PCR 缓冲液30 mM MgCl210 μl程序 294°C 1秒 
 500 mM Tris pH8  55°C 1秒 
 2.5 mg/ml BSA  72°C 20秒 
 5% Ficoll 400  40个循环 
 10 mM Tartrazine  斜率 = 2.0 
引物 r (f)*CCTGCTATTACTGGTGATC4 μl程序 372°C 4分钟170 bp
引物 r (r)*GTTGAAGGGAAGCCAGCAG4 μl   
引物 z10 (f)*GCACTGGCGTTACTCAATCTC4 μl  360 bp
引物 z10 (r)*GCATCAGCAATACCACTCGC4 μl   
DMSO 5 μl   
dNTP10 mM2 μl   
Taq5 units/μl2 μl   
  90 μl   
PCR主混合液热循环仪（Rapidcycler）
试剂组成/浓度用量 参数预期大小
H2 1,2/e,n,x     
dH2O 63.6 μl程序 194°C 1分钟 
10X PCR 缓冲液20 mM MgCl210 μl程序 294°C 1秒 
 500 mM Tris pH8  55°C 1秒 
 2.5 mg/ml BSA  72°C 20秒 
 5% Ficoll 400  40个循环 
 10 mM Tartrazine  斜率 = 2.0 
引物 1,2 (f)*AGAAAGCGTATGATGTGAAA2 μl程序 372°C 4分钟290 bp
引物 1,2 (r)*ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC2 μl   
引物 e,n,x (f)*TAACTGGCGATACATTGACTG2 μl  150 bp
引物 e,n,x (r)1TAGCACCGAATGATACAGCC2 μl   
DMSO 5 μl   
dNTP10 mM2 μl   
Taq5 units/μl2 μl   
  90 μl   
通用 H2     
dH2O 72 μl程序 194°C 1分钟 
10X PCR 缓冲液30 mM MgCl210 μl程序 294°C 10秒 
 500 mM Tris pH8  45°C 10秒 
 2.5 mg/ml BSA  72°C 35秒 
 5% Ficoll 400  40个循环 
 10 mM Tartrazine  斜率 = 2.0 
引物 fljB (f) *CAAGTAATCAACACTAACAGTC2 μl程序 372°C 4分钟1,500 bp
引物 fljB (r) *TTAACGTAACAGAGACAGCAC2 μl   
dNTP10 mM2 μl   
Taq5 units/μl2 μl   
  90 μl   

表1. 实验方案 沙门氏菌 鞭毛等位基因分型 PCR：组分、条件及预期结果

*PCR寡核苷酸引物的工作贮存浓度为25 μM

分离株O 等位基因H1 等位基因H2 等位基因血清型
 BC1C2D1Eig,mrz101,2; 1,5; 1,6; 1,7 e,n,x; e,n,z15通用型1 
1---+--+-----肠炎沙门菌
2--+-----+-++哈达尔/伊斯坦布尔3
3--+--+-----+肯塔基
4----+----+-+未知
5-+----+-----蒙得维的亚
6-+-----+-+-+婴儿沙门菌或维希沙门菌2
7-+------+-++姆班达卡
8+----+---+-+鼠伤寒沙门菌
9+------+-+-+海德堡沙门菌
10+-------++-+海法

表2. 等位基因分型PCR结果（图1）及 沙门氏菌 基于O、H1和H2等位基因鉴定的血清型命名

> 1H2 PCR 可扩增所有携带 H2 鞭毛蛋白（无论 H2 等位基因类型）的 Salmonella，产生 1.5 kb 的扩增片段（1）。该 PCR 用于区分单相型与双相型 Salmonella。
2H2 多重 PCR 无法区分 H2 1,2；1,5；1,6；1,7 抗原复合体的不同等位基因（3）。
3肠炎沙门菌哈达尔血清型（S. enterica serovar Hadar）经噬菌体转化后，其脂多糖 O 抗原发生改变，从而形成伊斯坦布尔血清型。O 等位基因分型 PCR 无法识别这些细微的遗传/抗原变化。

血清型1O 抗原等位基因H1 抗原等位基因H2 抗原等位基因
 BC1C2D1Eig,mrz101,2; 1,5; 1,6; 1,7 e,n,x; e,n,z15通用型2
California + - - - - - + - - - - -
Typhimurium + - - - - + - - - + - +
Heidelberg + - - -- -- +- +- +
Haifa + -- -- -- - ++ - +
Montevideo - + - - -- +- -+ - +
Othmarschen -+ -- -- + -- -- -
Athinai - + -- -+ -- - - ++
Papuana- + -- -- -+ -- ++
Mbandaka - + -- -- - - +- ++
Chincol -- + - - - + - -- + +
Kentucky -- + -- +- -- - -+
Hadar/Istanbul3- - +- - - -- +- ++
Enteritidis -- - +- -+ - - -- -
Seremban - - -+ - + - - -+ - +
Campinense -- -+ -- - +- - + +
Lome- - -+ - - -+ -- - +
Portland - - - +- - -- + + - +
Ruanda - - -+ -- - - + -+ +
Treguier - -- +- - -- +- - +
Simi - - -- +- -+ - - ++
Weltevreden - - -- + -- + - -- +
Kristianstad -- - -+ - - - +- ++
Biafra - - -- + -- - +- -+

表3.鼠伤寒沙门氏菌 通过等位基因分型PCR鉴定的血清型

1加粗标示的血清型是在诊断或食品微生物学实验室中更常遇到的。
2H2 PCR 可为所有携带 H2 鞭毛蛋白（无论 H2 等位基因类型如何）的Salmonella产生 1.5 kb 的扩增片段。该 PCR 用于区分单相和双相Salmonella。
3肠炎沙门氏菌（S. enterica）哈达尔血清型经噬菌体转化后，其脂多糖 O 抗原发生改变，从而形成伊斯坦布尔血清型。O 等位基因分型 PCR 无法分辨这些细微的遗传/抗原变化。

讨论

大多数市售的用于检测的PCR检测方法 沙门氏菌 特异性靶向该属独有的基因（例如 invA）。然而，并非所有 沙门氏菌 在人类致病能力或动物群体中的流行率方面并无差异。抗原差异的早期识别在 沙门氏菌 LPS O-抗原以及鞭毛素H1和H2抗原已导致了分化 沙门氏菌 根据这些抗原差异，可分为超过2,500种血清型。该属中已鉴定出46种不同的O抗原和86种不同的鞭毛蛋白（H）抗原。 沙门氏菌. 沙门氏菌 可能具有一条（H1）或两条不同的（H1&H2）鞭毛蛋白。不同的O、H1和H2抗原组合构成了2,500种血清型 沙门氏菌 目前公认的血清型。血清型的指定基于通过鉴定个体O抗原和H抗原得出的抗原式。抗原式写作O:H1:H2；其中“-”表示H1或H2鞭毛蛋白缺失，“NT”（不可分型）表示无法定型 沙门氏菌 O抗原阴性。例如，伤寒沙门菌血清型被归入一个 S. enterica 分离株的抗原公式为 B: i: 1,2，而具有 D1: g,m: - 公式的分离株则归为肠炎沙门菌。这种抗原变异在 沙门氏菌 种群的差异在核苷酸水平上表现明显，因此可通过PCR技术轻松加以利用。

我们已鉴定出与特定O和H等位基因相关的遗传差异，从而开发了一种等位基因分型PCR，用于鉴定S. enterica的血清型：Enteritidis、Hadar、Heidelberg和Typhimurium（3）。准确判定和报告Salmonella血清型，需要检测与Enteritidis（D1: g,m: -）、Hadar（C2: z10: e,n,x）、Heidelberg（B: r: 1,2）和Typhimurium（B: i: 1,2）对应的O: H1: H2抗原组合所关联的所有等位基因。若不了解O等位基因或抗原类型，仅发现H1 g,m等位基因并不能确定该Salmonella分离株即为Enteritidis，因为其他Salmonella血清型如Agona、California和Montevideo也具有相同的等位基因。尽管该等位基因分型PCR最初设计用于检测上述提及的Salmonella血清型，但该检测还可识别另外19种血清型（表3）。我们的等位基因分型PCR最初旨在检测O和H等位基因。在实际操作中，对于分离的Salmonella培养物，使用O特异性抗血清进行玻片凝集试验来鉴定O抗原，比进行O等位基因分型PCR更为实用且成本更低。然而，如果您的实验室将O等位基因分型PCR用作筛查手段（2），或用于鉴定提交在FTA卡片上的Salmonella分离株（6），我们建议使用该方法，并在样本初筛时同时包含Salmonella特异性PCR（4）。应将等位基因分型PCR限定于那些已通过PCR或生化/抗原检测确认为Salmonella的样本。

本文所述方案已针对Idaho Technology Rapidcycler进行优化，该仪器为热空气热循环仪，可减少反应体积，并且运行反应条件所需时间少于许多加热块式热循环仪。若将本方案适配至加热块式热循环仪，可能需要通过降低或提高退火温度、调整引物浓度或调整MgCl2浓度等方式，对反应条件进行经验性优化。例如，我们已将本方案适配至MJ Research PTC-200热循环仪，具体如下：采用表1中所述相同反应体积，i引物组的工作储备浓度稀释至2.5 μM，退火温度从55°C降至45°C，且在i/g、m等位分型PCR的变性、退火和延伸步骤中，孵育时间均延长至20秒。在任何PCR（包括已发表的方案）的初始启动和优化过程中，设置适当的阳性和阴性对照至关重要。我们建议获取已知的Salmonella血清型作为阳性对照，具体包括Anatum（E1: e,h: 1,6）、Enteritidis（D1: g,m: -）、Hadar（C2: z10: e,n,x）、Heidelberg（B: r: 1,2）、Montevideo（C1: g,m,s: 1,2,7）和Typhimurium（B: i: 1,2）；同时建议采用实验室常用的Escherichia coli K12菌株（如DH5α、LE393、JM109等）作为阴性对照，用于本文所述的等位分型PCR检测。这些Salmonella血清型中，部分将根据所检测的等位基因不同，分别作为阳性或阴性对照使用。

进行本实验及其他任何诊断性PCR时，需遵循特定的预防措施和指导原则。首先，模板制备、PCR反应体系构建以及凝胶电泳操作区域的物理分离至关重要，可有效防止PCR产物残留污染，避免假阳性结果的错误报告。此外，任何常规PCR实验中均需设置适当的对照，因为这些对照能够及时发现实验过程中出现的问题，并有助于结果的准确解读（5）。尤为重要的是实验条件的一致性，特别是扩增产物（PCR产物）检测及扩增片段大小估计所用的电泳条件。为说明这一点，图1A中我们有意提前终止了电泳过程。此时，分子量标准（第1和第13泳道）及阳性对照（第2泳道）的条带未能充分分离，无法准确估计片段大小，也无法清晰分辨DNA片段间较小的长度差异。˜50 bp）的大小。DNA片段（尤其是分子量标准）的充分分离至关重要，因为阳性结果的判定依赖于扩增片段大小的准确估算，并且需要区分“真阳性”与日常PCR运行中偶尔出现的非特异性扩增产物（5）。例如，在图1B第7泳道中存在一个非特异性扩增产物˜大小为700 bp）。如果电泳过早停止，当染料前沿仅迁移至琼脂糖凝胶的中点时，500 bp与700 bp的DNA片段之间将几乎没有区分开来。因此，第7泳道的样本将被错误地判读为同时含有i和g,m等位基因阳性。

最后，需要认识到任何检测方法都存在一定的局限性。部分H1/H2等位基因分型PCR无法有效区分属于H2 1,2；1,5；1,6；1,7抗原复合体、e,n,x/e,n,z15抗原复合体以及包含g,m等位基因的H1 G抗原复合体等位基因之间的细微遗传差异。这些鞭毛抗原中存在的不同表位通常仅由一至两个氨基酸的差异决定。因此，我们难以设计出能够有效利用鞭毛蛋白基因序列中有时仅为单个碱基对差异的引物（3）。例如， 沙门氏菌 血清型都柏林（D1: g,p: -）和贝尔塔（D1: f,g,t: -）使用我们的g,m等位分型引物也会产生PCR阳性结果。H2等位分型引物无法区分伤寒沙门菌（B: i : 1,2）与拉各斯（B: i: 1,5）、海德堡（B: r: 1,2）与布拉德福德（B: r: 1,5）、温尼巴（B: r: 1,6）或雷莫（B: r: 1,7），也无法区分哈达尔（C2: z10: e,n,x）与格洛斯特鲁普（C2: z10: e,n,z15）。尽管遇到拉各斯、布拉德福德、温尼巴、雷莫或格洛斯特鲁普等血清型的概率极低，但仍存在可能性，因此需在检测报告中注明该检测方法的局限性，或进行其他确证性检测。

综上所述，这种基于 PCR 的血清型分型方法可快速鉴定 S. enterica 血清型 Enteritidis、Hadar、Heidelberg 和 Typhimurium，以及与另外 19 种血清型相关的 O、H1 和 H2 等位基因。该检测方法是一种快速、经济高效的替代方案，可用于取代传统微生物学方法对 Salmonella 进行血清型分型。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国农业部资助项目（编号：1999-35212-8680、2005-01378 和 2010-04288-01）、美国农业部配方基金以及佐治亚州兽医医学农业研究基金的支持。本文所描述的实验方案最初为本科生指导性研究课程而设计，包括佐治亚大学的 MIBO 4900L、GENE 4960H、BCMB 4960L 和 BIOL 4960H 课程，并已在 Maurer 实验室的多项分子流行病学研究项目中由学生实际应用。我们谨向在 Maurer 和 Lee 实验室中从事研究工作的众多本科生，以及支持我们将本科教学与科研相融合工作的本系主任 John Glisson 表示感谢。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB培养基（Luria Bertani）Fisher Scientific（或任何可比来源）
微量离心管Fisher Scientific1.5 ml 容量（或任何可比来源）
乙醇Fisher Scientific200 proof（或任何可比来源）
dH2OSigma-Aldrich分子生物学级（或任何可比来源；仅用于PCR）
10 x PCR缓冲液：Idaho Technologies20 mM MgCl2（缓冲液含BSA、Ficoll和酒石黄）
30 mM MgCl2
40 mM MgCl2
PCR引物
DMSO
dNTPRoche Group（或任何可比来源）
Taq DNA聚合酶Denville Scientific（或任何可比来源）
毛细吸管Idaho Technologies10 µl 体积
快速PCR仪Idaho Technologies
琼脂糖Bio-Rad低电渗；分子生物学级（或任何可比来源）
50 X TAE缓冲液或5X TBE缓冲液Fisher Scientific（或任何可比来源）
溴化乙锭Bio-Rad（或任何可比来源）
带凝胶模具的水平浸没式凝胶电泳槽Bio-Rad（或任何可比来源）
电源Bio-Rad（或任何可比来源）
分子成像凝胶成像系统（Molecular Imager Gel Doc System）Bio-Rad（或任何可比来源）
表4. 材料

参考文献

  1. Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica. J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.
  2. Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles. J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).
  3. Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles. BMC Microbiol. , (2008).
  4. Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments. J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).
  5. Maurer, J. J. Rapid detection and limitation of molecular techniques. Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).
  6. Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper. Avian Dis. 50, 391-396 (2006).
  7. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
  8. Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air. Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).

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PCR PCR O H1 PCR DNA
一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌
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