使用冲击管装置在脑切片中诱导创伤性损伤

摘要

来源：Campos-Pires, R.，等。一种新型体外爆震性脑损伤模型。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，通过受控加压使聚合物隔膜破裂，利用激波管装置产生激波。激波作用于固定在密封袋中的脑切片，从而诱导脑切片发生创伤性损伤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 海马器官型切片的制备与培养

注意：本方案可用于制备海马组织切片。理想情况下，每次实验不应超过三只动物同时进行处死和解剖，以确保每一步操作迅速完成，并避免切片质量下降。整个过程应采用无菌技术操作。

1. 开始解剖方案前，请确保完成以下步骤。
   1. 提前配制所有溶液，并使用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。
   2. 在储存期间以及整个脑组织解剖和海马切片制备过程中，将溶液保持在 4 °C；始终将储存容器和培养皿置于湿冰上的金属散热板上。
   3. 对所有金属器械、金属环和纸巾进行高压灭菌处理。
   4. 确保方案每一步所需的所有器械和材料均已准备就绪，提前摆放整齐，并用 70% 乙醇喷洒；然后让其冷却并自然干燥。
2. 通过颈椎脱位法处死一只出生 5–7 天的 C57BL/6N 小鼠幼崽，并用浸有 70% 乙醇的无菌纸巾轻轻擦拭整个体表皮肤。轻拍皮肤使其干燥，然后使用梅奥剪刀将幼鼠头部剪下。
3. 使用虹膜剪沿头部正中线从枕部区域开始向前至吻部附近剪开头皮，并将头皮向两侧牵开。
4. 将 Vannas 剪的尖端插入枕骨大孔，在横窦沿线的颅骨上做两个小的侧向切口，然后沿正中线向上剪至嗅球，并在此区域垂直于正中线做两个小切口。
5. 使用细尖弯镊将颅骨瓣向两侧牵开。小心用小刮匙取出脑组织，并转移至一个盛有“解剖液”的 90 mm 硅橡胶涂层培养皿中。
   注意： 解剖液为盖氏平衡盐溶液（含 5 mg/mL D-葡萄糖、1% 抗生素-抗真菌溶液、10,000 单位/mL 青霉素、10 mg/mL 链霉素和 25 µg/mL 两性霉素 B）。
6. 使用刀片切除小脑，并沿正中线分离大脑半球。用刮匙将大脑半球转移至另一个装有新鲜冰冻解剖液的 90 mm 硅橡胶涂层培养皿中。若一次实验需使用多只动物，请重复步骤 1.2–1.6。
7. 在体视显微镜下，使用刀片切除嗅球和额叶皮层尖端，并用细头镊子将大脑皮层与其他脑组织分离。此步骤可使海马在皮层组织内侧表面暴露。从本步骤开始，应在层流式组织培养罩内操作（已进行紫外线灭菌并用 70% 乙醇溶液清洁）。
8. 将冰冻的解剖液滴加至平坦的塑料切片盘上，并用刮匙将脑组织置于切片盘上，使皮层内侧面朝上，海马轴线与切片刀轴线垂直。
9. 使用细口巴斯德吸管尽可能吸除切片盘中的解剖液。
10. 使用组织切片机以 50% 的切割速度和力度将脑组织切成 400 µm 厚的切片。
    注意： 此步骤应尽快完成，因为脑组织未浸没在解剖液中。
11. 将硅橡胶涂层培养皿中的解剖液更换为新鲜的冰冻解剖液。
12. 切片完成后，小心将脑组织重新浸入新鲜解剖液中，并使用直刃手术刀将切好的组织转移回 90 mm 硅橡胶涂层培养皿中。
13. 在体视显微镜下，使用细头镊子小心分离皮层切片。对每一片切片，检查海马形态以及是否存在因解剖或切片造成的组织损伤。
14. 使用细头镊子和小型 Vannas 剪，将海马从内嗅皮层和海马伞中分离出来。通常每个半球可获得约 6 至 8 片海马切片。
15. 使用剪口的巴斯德吸管将最多 6 片海马切片转移至组织培养插入式小室中，并将其放入 35 mm 培养皿内。确保切片之间间隔数毫米（以保证每一片均可单独成像）。
16. 立即向每个培养皿底部、组织培养插入式小室下方加入冰冻的“生长培养基”，液面高度应略低于插入式小室边缘顶部。
    注意： 生长培养基包含 50% Eagle 最低必需培养基、25% Hank's 平衡盐溶液、25% 马血清、5 mg/mL D-葡萄糖、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1% 抗生素-抗真菌溶液和 10 mmol/L HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。
17. 解剖后的第二天更换一次生长培养基，之后每 2 至 3 天更换一次（使用 37 °C 的生长培养基）。确保添加的生长培养基量足够，但不可过多，以免溢过组织培养插入式小室的膜表面，从而影响组织切片的存活率。
18. 在用于实验前，将组织切片置于含 5% 二氧化碳的湿润化培养箱中，于 37 °C 培养 12 至 14 天。

2. 实验性爆炸性创伤性脑损伤方案用海马器官型切片的制备

注意：本节步骤除成像外，均在层流组织培养罩内进行。

1. 将定制的不锈钢环插入6孔板中（每孔一个）。
   注意事项：环状物边缘带有一个切口（应置于12点钟位置），可紧密地嵌入孔内，而组织培养插入物可轻松置于该边缘上。确保提前用杀菌消毒剂清洗环状物，用纯化水彻底冲洗，高压灭菌，并冷却备用。
2. 用预热（37 °C）的含碘化丙啶的无血清“实验培养基”填充6孔板的孔。
   注意： 含碘化丙啶的实验培养基为75% Eagle最低必需培养基、25% Hank平衡盐溶液、5 mg/mL D-葡萄糖、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1% 抗生素-抗真菌素溶液、10 mmol/L HEPES 和 4.5 µmol/L 碘化丙啶，用氢氧化钠调节pH至7.2。
3. 确保培养基液面不超过环形孔的凹槽。将带有环形孔的6孔板转移回培养箱中孵育1小时，以保证在转移组织培养小室前培养基温度达到37 °C。
4. 使用镊子将带有类器官切片的组织培养小室从35 mm培养皿转移至含有支撑环和实验培养基的6孔板中。
5. 用永久性记号笔在插入件边缘的3点钟位置做一个标记点。
   注意： 实验过程中将从6孔板中取出插入物。此步骤有助于在暴露于冲击波后将插入物放回原始位置，并可方便地在整个实验流程中追踪每一片组织。
6. 为每个6孔板标记唯一的名称 & 日期，并对每块板的孔位进行制图，为每个孔命名（例如A，B，C 等等）以及每个孔中的每一片（例如., 1, 2, 3, 等等），以便每个切片都有一个唯一的标识符（例如A1, A2, A3 等等.).
7. 将6孔板转移至培养箱中，成像前立即孵育1小时，以确保切片温度达到37 °C。
   注意： 避免培养插件膜下出现培养基溢出或气泡，以免影响组织切片的活性。
8. 转移至实验培养基后1小时，使用配备适当激发滤光片（BP 535/50 nm）和发射滤光片（LP 610 nm）的荧光显微镜（2倍物镜，NA 0.06），对每一片组织切片单独成像，以在实施损伤实验方案前评估切片的健康状态。
   注意事项： 在此阶段呈现密集红色染色区域的切片应被视为活性受损，需排除在后续分析之外（此类切片通常占总切片数的不到10%）。应确保成像按顺序尽快进行，以尽量缩短切片在培养箱外的时间（通常6个孔的成像耗时略少于30分钟）。
9. 始终盖好6孔板的盖子。盖子内部可能会产生一些冷凝水。如果发生这种情况，可短暂使用低档位的吹风机吹干。
10. 确保不同日期及不同实验之间的成像条件完全一致。
    注意： 成像的目的是定量组织荧光强度，因此该步骤对于确保结果的可重复性以及实现数据间的可比性至关重要。

3. 浸没与转运含有海马器官型切片的组织培养插件

1. 成像后立即在超净工作台中用镊子从6孔板中取出一个组织培养插件。
2. 小心地将插件转移至已预先装有20 mL温热（37 °C）实验培养基的无菌聚乙烯袋（3英寸×5英寸）中，该培养基需用95%氧气和5%二氧化碳新鲜通气处理。
   注意： 确保在德雷斯尔瓶内使用烧结玻璃通气器，将实验培养基用95%氧气和5%二氧化碳持续通气至少40分钟，并在超净工作台内使用带细菌过滤器的20 mL注射器和连接的无菌填充管（127 mm）转移至无菌聚乙烯袋中。密封袋后立即放入37 °C培养箱中，于组织培养插件转移前至少孵育1小时。
3. 确保每个无菌袋均正确标记（注明板号和孔位编号）。对每个组织培养插件重复此步骤。在密封无菌袋时小心排除气泡（通过扭转袋口并夹紧塑料夹来牢固密封）。
4. 将装有组织培养插件的无菌袋以及含有实验培养基的6孔板放回37 °C培养箱中。
5. 1小时后，将装有组织培养插件的无菌袋小心地放入塑料盒中，并置于充满37 °C去离子水的温控箱内，以在整个冲击波暴露过程中维持类器官切片的生理温度。

4. 冲击管的制备与海马器官型脑片冲击波暴露

1. 在准备冲击管和施加冲击波时，需穿戴钢头防护靴、实验服和手套。
2. 将无菌袋支架框架用螺栓固定在冲击管远端法兰上，确保其中心孔与冲击管出口对齐（使用堵杆进行校准）。
3. 径向安装两个压力传感器：传感器1位于驱动段中部，传感器2位于冲击管的远端法兰处（图1A）。通过恒流电源单元将压力传感器连接至示波器。
4. 确保所有冲击管释放阀和流量控制阀均处于关闭状态。
5. 打开外部压缩空气管线，并将电磁阀充气至2.5 bar。
6. 打开压缩空气钢瓶的安全阀，缓慢打开压力调节器，将压力升至约5 bar。
   注意：该调节器设定的压力应略高于隔膜破裂压力的最大值。
7. 准备隔膜：将23 µm厚的聚酯薄膜裁剪成10 × 10 cm²的正方形。使用高压灭菌胶带制作手柄，并将其粘贴在每张隔膜的顶部和底部。
8. 在膛室中放置一张隔膜（双膛单槽——单隔膜配置）或两张隔膜（双膛双槽——双隔膜配置）（图1B）。
9. 将隔膜居中，并使用四个M24螺栓和螺母按对角对称顺序依次拧紧夹紧，确保隔膜无褶皱。
10. 将每个无菌袋单独垂直夹紧在支架框架上，确保含有类器官型海马切片的组织培养插入物表面朝向冲击管出口，且组织培养插入物位于无菌袋中心（图1C）。确保无菌袋四周牢固夹紧，以实现稳定且均匀的固定。
11. 在对冲击管加压时，需佩戴耳罩和护目镜。打开恒流电源单元和示波器以采集冲击波数据（采样速率为50兆样本/秒，记录长度为20 ms，共100万个数据点），然后关闭电磁阀。
12. 使用冲击管控制面板上的流量控制旋钮，缓慢对驱动段加压（单隔膜配置），或同时对驱动段和双膛段加压（双隔膜配置）。
    注意：对于单隔膜配置，破裂压力仅取决于隔膜材料和厚度，当达到材料的破裂压力时，隔膜将自发破裂。对于双隔膜配置，破裂压力还取决于驱动腔和双膛腔之间的气体压力差；为实现可控破裂，需在达到目标压力后手动打开双膛安全阀。
13. 一旦隔膜破裂（产生巨大声响），立即使用流量旋钮关闭压缩空气流，并打开电磁阀。
    注意：可通过插入堵块来调节驱动段的总体积，从而获得更广泛的冲击波峰值超压和持续时间。理想的冲击波参数组合应足以引起组织损伤，但又不能过高，以免导致组织培养插入物或无菌袋发生形变或破裂。
14. 每次仅暴露一个装有组织培养插入物的无菌袋，经一次冲击波处理后立即放回温控箱中，随后从箱中取出下一个无菌袋并夹紧在支架框架上。确保步骤4.10–4.14尽可能平稳迅速地完成（数分钟内），以防止实验培养基冷却，因温度低于37 °C可能干扰损伤的发展。
15. 所有组织培养插入物完成冲击波暴露（或假处理程序）后，将其放回原始的6孔板中对应孔位（在超净台内操作），并放回培养箱。
16. 将6孔板置于37 °C、含5%二氧化碳的培养箱中，直至进行后续成像分析。
17. 每次实验及切片冲击波暴露均需设置假处理对照组。
    注意：假处理切片的处理方式与冲击波暴露切片完全相同（用实验培养基密封于无菌袋中，置于相同的温控箱中运输至冲击管实验室，并在金属支架上悬挂相同时间），但不触发冲击管。

结果

图1：带无菌袋固定架的激波管装置示意图。（A）激波管是一根长3.8 m的不锈钢管，由三段各长1.22 m的管段通过垫圈和法兰连接而成，内径为59 mm。（B）插图为双闭锁组件结构。一个或两个聚酯薄膜隔膜可通过橡胶O形圈密封后夹紧在该组件中。（C）无菌袋固定架。支架本体由两块金属板组成，中央有一个圆形孔（直径59 mm），与激波管出口对齐。两片薄（4 mm）硅橡胶弹性体片被安装在两块金属板之间。这些弹性体片的作用是提供均匀且防滑的表面，以夹紧无菌袋。无菌袋与激波管出口之间的距离为7 cm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Geys 平衡盐溶液	Sigma UK	G9779
D-葡萄糖	Sigma UK	G8270
抗生素/抗真菌剂	Sigma UK	A5955
最低必需培养基 Eagle	Sigma UK	M4655
Hanks 平衡盐溶液	Sigma UK	H9269
马血清	Sigma UK	H1138
L-谷氨酰胺	Sigma UK	G7513
HEPES	VWR Prolabo, Belgium	441476L
氢氧化钠	Sigma UK	S-0945
组织培养小室	Millicell CM 30 mm 低高度 Millipore	PICM ORG 50
6 孔板	NUNC, Denmark	140675
碘化丙啶	Sigma UK	P4864
无菌聚乙烯袋 - Twirl'em 无菌样品袋	Fisherbrand	01-002-30
Portex Avon Kwill 灌注管 5" (127 mm)	Smiths Medical Supplies	E910
落射荧光显微镜	NIKON Eclipse 80i, UK
显微镜物镜	Nikon Plan UW 放大倍数 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
显微镜滤光片	Nikon G-2B（长通发射）
Mylar 电气绝缘膜，304 mm × 200 mm × 0.023 mm	RS Components UK	785-0782
压力传感器	Dytran Instruments Inc.	2300V1
组织切片机	Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.	Mcllwain 组织切片机
硅橡胶弹性体	Dow Corning, USA	Sylgard 184