通过淀粉样肽注射在斑马鱼脑内建立阿尔茨海默病模型

摘要

Bhattarai, P., et al. 在成年斑马鱼大脑中建模淀粉样蛋白-β42 毒性及神经退行性变. J. Vis. Exp. (2017).

本视频演示了将单体淀粉样肽注射到成年斑马鱼前脑以产生淀粉样毒性，模拟阿尔茨海默病中观察到的神经元损伤。

方案

1. Aβ42 肽的制备

1. 使用标准的9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学法，在自动化固相多肽合成仪上以2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）作为偶联试剂合成多肽（见表1）。合成规模为100 µmol。
2. 在自动化多肽合成仪中装入500 mg Fmoc保护的树脂作为固相载体（载样量为0.2 mmol/g）。将溶解的Fmoc保护氨基酸以0.5 M的浓度按各合成仪所需体积装入。
   注意：计算时确保每种Fmoc保护氨基酸以五倍过量重复偶联两次至树脂上。
3. 将多肽合成所需试剂溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中。例如，将活化剂HBTU配制成0.48 M的浓度，加入45% v/v的N-甲基吗啉（NMM）（碱）和5% v/v的乙酸酐（封端混合液），用于封端未反应的氨基。
4. 在新鲜配制的裂解液中，通过振荡器持续搅拌固相载体，使所有多肽从树脂上裂解下来。裂解液组成为三氟乙酸（TFA）: 三异丙基硅烷（TIS）: 水 : 二硫苏糖醇（DTT）= 90 (v/v) : 5 (v/v) : 2.5 (v/v) : 2.5 (m/v)，反应4小时。对于100 µmol的合成规模，使用10 mL裂解液。
5. 将裂解液缓慢加入100 mL预冷的乙醚中以沉淀裂解产物。通过装有孔径为0.45 µm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜的过滤装置进行过滤，并用20 mL预冷的乙醚洗涤沉淀。
6. 收集滤纸上的多肽沉淀，取100 mg沉淀多肽溶于5 mL蒸馏去离子水与乙腈按1:1配制的混合溶液中。
7. 采用反相高效液相色谱法（HPLC），在配备粒径为10 µm多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱的半制备型HPLC系统上进行纯化。
   1. 使用柱温加热装置预热色谱柱并维持在50 °C。以4 mL/min的流速，在25分钟内采用5%至100%溶剂B的梯度洗脱，利用自动馏分收集器收集所有主要组分。
      注意：溶剂A为含0.1% TFA的水溶液，溶剂B为含0.1% TFA的乙腈溶液。
   2. 在220 nm波长下监测色谱图，收集相应峰组分，并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。
8. 通过反相超高效液相色谱（UPLC）在220 nm波长下检测纯度，样品经分析型C18色谱柱（粒径1.7 µm）分离时使用紫外（UV）检测器进行监测。通过质谱确认多肽产物。
   注意：UPLC系统连接电喷雾电离质谱（ESI-MS）及串联四极杆检测器。
9. 将目标多肽的正确馏分置于圆底烧瓶中，在0.052 mbar真空条件下冻干成疏松粉末。将真空泵连接至维持在-78 °C的冷冻装置。产物可长期保存于-80 °C。
10. 使用冻干多肽配制1 mM的储备液，溶剂为乙腈、DMF与色谱纯水按1:1:1比例混合。该溶液可稳定保存至少6个月，因多肽在此溶液中不发生聚集。

2. 注射混合物的制备

1. 准备磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄，pH 7.4），用于稀释冻干肽。
2. 将肽溶解于PBS中，使其终浓度为20 µM。现用现配，充分混匀后置于冰上保存至注射前。为防止溶液中发生聚集，操作时间不得超过30分钟。

3. 麻醉

1. 用循环系统的普通养鱼水配制麻醉剂的储备液，即0.1%的乙基-间-氨基苯甲酸甲磺酸盐（MESAB）。将麻醉液稀释至最终浓度为0.0025%（v/v）。
2. 从鱼缸中取出所需数量的鱼，放入装有5 L系统水的运输容器中。
3. 用40 mL麻醉剂半充满一个塑料培养皿（90 mm），用于后续注射操作。
4. 将鱼在麻醉剂中孵育，直至鳃盖运动停止。

4. 脑室微量注射

1. 注射装置的制备
   1. 使用针头拉制仪制备玻璃注射毛细管，设置参数如下：加热循环，537；拉制循环，250；速度，1.5 秒；时间，80 毫秒。
   2. 将压力源的压力设定为 25 psi。
   3. 设置显微注射仪的参数：维持压力为 20 psi，喷射压力为 10 psi，周期为 2.5，门控时间为 100 毫秒。
   4. 用注射溶液填充玻璃毛细管。将玻璃毛细管插入显微注射持针器中，并调整注射角度至 45°。
2. 将一条鱼放入盛有麻醉溶液的新培养皿中。
3. 用镊子夹住鱼体并调整至适合注射的方位。
4. 使用 30 G 针头的尖端在视顶盖上方的颅骨处（即两侧骨板交汇处）制造一个切口。切勿将针尖插入脑组织，以免引起出血和损伤。
5. 将玻璃毛细管插入切口。
   1. 仅使用针头的尖端，穿透颅骨深度不得超过 1 mm。持续固定鱼体，并将玻璃毛细管的尖端通过切口部位插入。
   2. 将玻璃毛细管的尖端朝向端脑方向，保持 45° 角。注射 1 µL 溶液，液体在注射后立即扩散。

5. 恢复

1. 将鱼放回运输容器中，直至其恢复。将容器连接到持续循环的养鱼用水系统，以确保最佳水质。
   注意： 恢复通常需要1分钟。如果耗时更长，则必须缩短鱼在麻醉剂中的暴露时间（实验人员需对此进行优化）。

结果

表1：Aβ42 和 TR-Aβ42 肽序列。

肽	肽序列	分子量 (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	5919.8

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fmoc保护的氨基酸	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)		用于固相多肽合成（SPPS）的Fmoc法氨基酸
N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐（HBTU）	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1030	活化剂
氧化吗啉（Oxyma）	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	RL-1180	消旋抑制剂
N,N-二异丙基乙胺	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-003	碱
二甲基甲酰胺	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)	SOL-004	溶剂
N-甲基吗啉	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany	A12158	碱
1-羟基苯并三唑水合物（HOBT）	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)	157260 ALDRICH	活化剂
哌啶	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	822299	Fmoc脱保护试剂
二氯甲烷（DCM）	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	106050	溶剂
甲酸（FA）	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	100264	HPLC缓冲液组分
三氟乙酸（TFA）	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	808260	裂解混合试剂
三异丙基硅烷（TIS）	MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)	233781 ALDRICH	裂解混合试剂
乙腈（用于UPLC/LCMS）	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	溶剂
乙腈（用于HPLC）	VWR International Ltd, England	83639.32	溶剂
乙醚	VWR International Ltd, England	23811.326	用于多肽沉淀的溶剂
二硫苏糖醇（DTT）	VWR International Ltd, England	0281-25G	裂解混合试剂
TentaGel S RAM Fmoc Rink酰胺树脂	Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)	S30023	SPPS固相载体
5 ml带滤膜的多肽合成注射器	Intavis AG (Cologne, Germany)	34.274	SPPS反应管及固相裂解用管
聚四氟乙烯（PTFE）滤膜	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	11806-50-N	沉淀多肽的过滤
聚偏二氟乙烯（PVDF）注射器滤膜	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	HPLC前过滤
多肽合成仪	Intavis, Cologne, Germany	ResPep SL	自动化固相多肽合成仪
Water Alliance HPLC	Waters, Milford Massachusetts, USA	Waters 2998, Waters e2695	半制备型反相高压液相色谱（HPLC）
PolymerX，粒径10μm，250x10 mm	Phenomenex Ltd. Germany	00G-4328-N0	多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯HPLC色谱柱
Milli-Q Advantage A10，配备Milli-Q滤膜	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA	LCPAK0001	水纯化系统
过滤装置	Sartorius Stedtim (Aubagne, France)	16307	用于多肽沉淀的过滤单元
UPLC Aquity 配备紫外检测器	Waters, Milford Massachusetts, USA	M09UPA 664M	用于LC-MS的分析型反相超高效液相色谱（UPLC）
ACQUITY UPLC BEH C18，粒径1.7 μm，50x2.1 mm	Waters, Milford Massachusetts, USA	186002350	分析型C18色谱柱
ACQUITY TQ检测器	Waters, Milford Massachusetts, USA	QBB908	电喷雾电离质谱（ESI-MS）
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany	16706, 101542	配备真空泵的冷冻干燥仪
Paradigm酶标仪	Beckman Coulter
MESAB（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma-Aldrich	A5040
培养皿	Sarstedt	821.472
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies, GIBCO	10010-056
针头	Becton-Dickinson	305178
解剖显微镜	Olympus, Leica, Zeiss	因制造商而异
Dumont镊子	World Precision Instruments	501985
Gillies解剖镊	World Precision Instruments	501265
玻璃注射毛细管	World Precision Instruments	TWF10
PicoNozzle	World Precision Instruments	5430-12
气动PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
环形照明器；环形导光管	Parkland Scientific	ILL-RLG