来源：Jean, Y. Y. 等，将寡聚化β-淀粉样蛋白立体定位注入小鼠海马体。J. Vis. Exp. (2015)
本视频展示了将淀粉样蛋白 β 精确定位注入小鼠齿状回以建立阿尔茨海默病小鼠模型的操作过程。准确的坐标定位和可控的淀粉样蛋白 β 输注可导致神经元退化，破坏记忆处理功能，从而促进阿尔茨海默病的发生发展。
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方法文章
直接立体定位脑内注射淀粉样蛋白-β构建阿尔茨海默病模型
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。
1. 准备手术器械和手术用溶液
- 将所有不锈钢外科手术器械进行高压灭菌。
- 通过将200 proof的无水乙醇用无菌分子级去离子蒸馏水稀释，配制70%乙醇溶液。
- 将29 G针头连接至Hamilton注射器。通过反复吸取和推出超纯水持续1分钟，清洗Hamilton注射器内部及针头。随后用70%乙醇重复此操作。
- 从Hamilton注射器上取下推杆和针头，在层流罩中过夜晾干。
- 使用前用紫外光照射针头和注射器30分钟。
- 将氯化钠（NaCl）溶解于分子级水中，配制终浓度为0.9%（重量/体积）的生理盐水溶液。通过0.2 μm孔径滤膜过滤对该溶液进行灭菌。
2. 制备寡聚化淀粉样蛋白-β（Aβ1-42）
- 按照 Fa' 及其他人的出版物中所述方法，将重组人 Aβ1-42 在二甲基亚砜（DMSO）中单体化并重悬至 5 mM。
- 在手术前一天，用无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）将 5 mM Aβ1-42 稀释至 100 µM。
- 通过吹打充分混匀溶液。
- 将 Aβ1-42 溶液在 4˚C 下孵育 12 小时。
注意： 对照溶液（如将 DMSO 稀释于 PBS 中，或使用乱序/反向 Aβ1-42 肽）应与 Aβ1-42 溶液以相同方式制备。
3. 确定注射坐标
- 使用成年小鼠脑图谱确定目标脑区的精确前后（AP）、内外（ML）和背腹（DV）坐标。
注意： 为演示该技术，我们选择海马齿状回作为靶区，其相对于前囟的坐标如下：AP，-2.00 mm；ML，±1.3 mm；DV，-2.2 mm。AP值前的负号表示该位置位于前囟后方2.00 mm处。ML值前的±符号表示从中线向左和向右的方向。最后，DV值前的负号表示从脑表面向腹侧方向移动。
4. 立体定位仪设置
- 佩戴外科口罩、洁净的实验服和无菌外科手套。
- 用70%乙醇擦拭立体定位仪和小鼠适配器。
- 在操作台面上铺上无菌手术单。
- 将带有小鼠适配器的立体定位仪放置在无菌手术单上。
- 用70%乙醇擦拭小鼠加热垫。将加热垫置于立体定位仪床体上方，并使用通用实验室标签胶带将其固定在小鼠适配器床体上。
- 根据制造商说明，将加热垫连接至温水循环泵。
- 开启温水循环泵，将温度设定为37 °C，并等待其达到设定温度。
- 按照制造商说明，通过将装有29 G针头的50 µl Hamilton注射器旋紧至电动垂直注射轴上，将其固定在立体定位仪上。
- 开启 bead 除菌器，并等待其达到制造商预设温度。
注意：该设备用于在不同动物之间对不锈钢器械进行灭菌。器械需与玻璃珠接触20秒方可完成灭菌。 - 开启加热板，将其温度设置为42 °C，并在其上方放置一个洁净的空笼子。
- 当Hamilton注射器固定在立体定位仪上时，使用电动立体定位注射器吸取Aβ1-42溶液。
注意：先吸入超过4 μl的溶液至注射器中，然后使用立体定位注射器设定注射体积。请按照制造商的操作说明运行注射器。
5. 动物准备
- 使用电子天平测定小鼠的体重。
- 通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉，剂量为氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg。通过检测脚趾夹捏反射是否消失来监测麻醉深度。
- 小鼠麻醉后，使用毛发剪刀剃除头部毛发，暴露颅骨表面皮肤。
- 将小鼠放置在立体定位仪的加热垫上。
- 使用刮铲打开小鼠口腔，并将门齿固定在门齿夹中。将鼻部固定装置覆盖在小鼠面部，轻轻夹紧，避免过紧。
- 将双侧耳杆插入外耳道以固定头部。移动每侧耳杆直至接触颅骨，然后旋转螺钉将其锁紧。
- 为确认头部已牢固固定，可用食指轻轻下压头部。若头部固定良好，则按压时不会松动或移动。
- 在小鼠双眼滴加眼膏或眼药水以保持湿润。确保在整个手术过程中眼睛保持湿润状态。
- 使用无菌棉签将聚维酮碘溶液涂抹于颅骨表面皮肤进行手术区域消毒，随后使用70%乙醇擦拭。重复交替使用聚维酮碘和70%乙醇清洁过程共两次。
6. 手术与灌注
- 使用手术刀在头皮正中线处做一个 2-3 mm 的切口，然后使用直头精细剪刀将切口延长至 1.0–1.5 cm，以暴露颅骨上的矢状缝、前囟（bregma）和后囟（lambda），这些是立体定位坐标所依据的解剖标志。使用微型夹钳将皮肤固定并分开。
注意： 前囟和后囟的位置详见小鼠脑图谱《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》。 - 取一根棉签，蘸取无菌生理盐水，清洁颅骨表面，然后使用干净干燥的棉签将颅骨擦干。
- 使用无菌细尖笔在前囟处标记一个点。使用立体定位仪上的微操纵器调整 Hamilton 注射器的位置，使针尖刚好接触前囟标记点。
- 记录此时的背腹（DV）坐标。
- 为检查颅骨前后（AP）轴是否水平，将 Hamilton 注射器向后移动，使针尖接触后囟点。
- 记录此时的 DV 位置。确保前囟与后囟的 DV 坐标差异在 0.5 mm 以内。
注意： 目标是尽量减小前囟与后囟之间的 DV 坐标差异。
- 使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖重新移回前囟标记点。
- 记录起始的前后（AP）位置。
- 通过从起始 AP 坐标减去 2.00 mm，计算出目标 AP 坐标。
- 使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖重新定位至目标 AP 坐标。
- 记录当前的内外侧（ML）坐标。
- 通过在起始 ML 坐标基础上加或减 1.3 mm，计算出左右两侧的目标 ML 坐标。
- 使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖移动至任一侧的目标 ML 坐标。
- 将针尖轻触颅骨表面两侧目标 ML 坐标位置，记录对应的 DV 坐标，并确保两个 DV 值差异在 0.5 mm 以内。
注意： 目标是尽量减小两个目标 ML 坐标之间的 DV 坐标差异。 - 在目标坐标处，将针尖抬高 0.5–1 cm 超出颅骨表面。使用无菌细尖笔在颅骨表面标记一个点。对侧颅骨重复此步骤。
- 将针尖轻触颅骨表面两侧目标 ML 坐标位置，记录对应的 DV 坐标，并确保两个 DV 值差异在 0.5 mm 以内。
- 将 Hamilton 注射器移开操作区域。
- 将 0.8 mm 钻头安装至钻机上。双手持握钻机，将肘部置于操作台面以保持稳定，将钻头置于左侧或右侧 ML 标记点略上方。启动钻机，缓慢下放钻头至颅骨表面，钻出颅骨孔。对对侧颅骨重复此步骤。
注意： 新钻出的颅骨孔可能出现少量出血。如有出血，使用干净干燥的棉签轻轻蘸除。 - 将 Hamilton 注射器重新移至任一侧新钻出的 ML 孔上方。缓慢下放注射针，使其刚好穿过颅骨。此时需特别小心，避免刺入脑组织。为确认针尖已穿过颅骨但未穿出骨孔，可用食指轻轻推动针体，检查其是否稳定位于骨孔内。
- 记录起始的背腹（DV）坐标。
- 通过从起始 DV 坐标减去 2.2 mm，计算出目标 DV 坐标。
- 将针缓慢下放至目标 DV 坐标位置。
- 启动立体定位注射泵，以 0.5 µl/min 的速度向齿状回（dentate gyrus）注入 4 µl 的 Aβ1-42。
- 注射完成后，保持针尖在原位静置 1 分钟，以尽量减少溶液从注射部位回流。
- 将针移至大脑对侧，重复步骤 6.13–6.18。
7. 动物移除与术后护理
- 拧下耳杆和面部/鼻部护具，将小鼠从装置中取出。
- 使用标准学生用镊子夹拢头皮，然后用缝合线闭合伤口。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸氯胺酮（100 mg/ml） | Henry Schein Medical | 1049007 | 每1 kg动物使用100 mg氯胺酮 |
| 赛拉嗪（20 mg/ml） | Henry Schein Medical | 暂无内容 | 每1 kg动物使用10 mg 咪唑嗪 |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | 暂无内容 | 100 μM；该淀粉样蛋白在论文中被使用 |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | 可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用 |
| Aβ1-42 | 美国肽 | 62-0-80B | 可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用 |
| 随机序列Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | 可用作对照肽以与 Aβ1-42 进行比较 |
| GenTeal 润滑眼用凝胶 | 诺华 | 暂无内容 | 用于手术过程中保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买 |
| Refresh Optive 润眼液滴眼液 | 艾尔建 | 暂无内容 | 用于手术过程中保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买；可替代GenTeal使用 |
| 聚维酮碘 | Stoelting | 50998 | 用于消毒和灭菌 |
| 圆形/锥形刮刀 | VWR | 82027-490 | 用于打开动物口腔 |
| Bulldog Serrefines 止血钳（钳口尺寸 9×1.6 mm；长度 28 mm） | 精细科学工具 | 18050-28 | 可选；用于注射时保持头皮皮肤分离 |
| 直头精细剪刀（刃长25 mm；全长11.5 cm） | Fine Science Tools | 14060-11 | 用于头皮切割 |
| #3 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 手术刀片 | Fine Science Tools | 10011-00 | 用于制作头皮切口 |
| 学生标准型镊子（尖端尺寸 2.5×1.5 mm；长度 11.5 cm） | Fine Science Tools | 91100-12 | 缝合时用于固定头皮闭合 |
| 修剪工具组合套装 | Kent Scientific | CL9990-1201 | 用于剃除毛发 |
| T/Pump 温水循环器 | Kent Scientific | TP-700 | 用于手术过程中动物的保温 |
| 可重复使用暖贴（5" ×10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | 用于将其连接至T/Pump温水循环器，以在手术期间为动物保温 |
| 无线微型钻机 | 斯托尔廷 | 58610 | 使用0.8 mm钢钻在颅骨上钻孔 |
| 用于小鼠的实验室标准立体定位仪 & 新生大鼠适配器 | 斯托尔廷 | 51615 | |
| 仅适用于小鼠立体定位仪 | 斯托尔廷 | 51730 | 可替代 Stoelting 货号 #51615 使用 |
| 经典立体定位注射器 | Stoelting | 53311 | |
| 干式玻璃珠灭菌器 | 斯托尔廷 | 50287 | 用于对不锈钢器械进行灭菌 |
| 无菌手术巾（18" ×26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton 50 ml 注射器，型号 705 RN SYR，NDL | Hamilton公司 | 7637-01 | 用于脑部注射时，不同溶液应使用不同的注射器 |
| 29号针头，小柄RN针 | Hamilton公司 | 7803-06 | 用于连接汉密尔顿注射器以进行脑部注射 |
| 1 ml BD 结核菌素注射器 | VWR | BD309659 | 用于麻醉剂和生理盐水的给药 |
| 30 号针头 (0.5") | VWR | BD305106 | 用于麻醉剂和生理盐水的给药 |
| Ohaus 便携式电子CS系列天平 | VWR | 65500-202 | 用于称量动物以确定麻醉剂量 |
| 加热板（顶板尺寸：7.25英寸×7.25英寸） | VWR | 47751-148 | 用于术后动物保温 |
| Sofsilk 丝线缝合线 C-1 3/8圆针，12 mm，角针 | Covidien | S1173 | 用于伤口闭合 |
| Vetbond 组织粘合剂 (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | 可选：辅助伤口闭合；需与缝合线配合使用。 |
| 无菌棉签（木柄） | Fisher Scientific | 22-029-488 | 用于外科伤口的清洁与干燥 |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 用于采集脑切片 |
| VWR 盖玻片 24 × 50 mm | VWR | 48393241 | 用于显微镜载玻片封片 |
| 赛默飞世尔科技 Nalgene 针头式滤器 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | 用于生理盐水溶液的灭菌 |
| Viscot Medical 无菌双头皮肤标记笔 | Medline | VIS1422SRL91 | 用于在颅骨上标记坐标 |
