研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

摘要

来源：Er, S. 等，在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中研究预先形成的纤维诱导的α-突触核蛋白聚集。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备

1. 配制多巴胺能神经元培养基（DPM），其中包含 0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 原霉素（primocin），用 DMEM/F12 补足体积。混合后过滤 DPM。将 DPM 储存于 4 °C，每份 aliquot 仅限预热一次。
   注意：DPM 中不应含有胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），因其会减少多巴胺能神经元中 α-突触核蛋白的聚集。
2. 准备硅化玻璃移液管，其表面极度疏水，从而在胚胎神经元初始操作过程中最大限度减少细胞黏附于管壁及细胞损失。
   1. 在 2 L 容器中，将 10 mL 硅化液加入 1 L 蒸馏水中，搅拌混匀。将玻璃移液管浸入硅化液中 15 分钟。
   2. 用蒸馏水冲洗移液管 3–5 次。在室温下过夜晾干，或在 100–120 °C 的无菌加热空间中干燥 1–2 小时以加快干燥过程。
   3. 将移液管装入密封的高压灭菌袋中，通过标准高压灭菌法进行灭菌。
3. 制备聚-L-鸟氨酸（PO）包被的 96 孔板（底部透明）：将 60 μL PO 溶液加入 96 孔板的中央孔中，用于后续接种神经元，板的边缘至少保留一整行或一整列孔不加，以避免边缘效应。包被后的孔板可在 4 °C 过夜或在室温下放置 4 小时。
4. 在接种细胞前，彻底吸除 PO 溶液，并用 100 μL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔内三次。吸除 1× PBS 后，打开孔板盖子使其完全干燥。
   注意：可回收使用过的 PO 溶液，经过滤后可重复使用。同一份 PO 溶液最多可重复使用两次。
5. 向预先包被的孔中加入 50 μL DPM。用 100 μL 塑料吸头从孔中吸除 DPM，同时以环形动作轻轻刮擦孔底边缘，去除孔周的包被层，使中央区域保留一个 PO 包被的小岛。
6. 在超净工作台内，向每个包被小岛的中央加入 10 μL DPM，以形成微小岛结构。
   注意：含有 DPM 覆盖微小岛的孔板可在超净台内放置 1–2 小时，用于细胞分离操作期间的临时保存。

2. 分离 E13.5 小鼠胚胎的腹侧中脑基板

注意：有关中脑腹侧解剖步骤，请参见图1。

1. 解剖前，将一个10 cm的培养皿中加入杜尔贝科缓冲液，并置于冰上备用。
2. 根据机构指南处死一只E13.5的妊娠雌性小鼠。将小鼠平躺仰卧，用70%乙醇喷洒其前躯体。用镊子提起子宫上方的皮肤，用手术剪剪开切口以暴露子宫。
3. 小心取出子宫，并将其放入预先准备好的、置于冰上的培养皿中。
4. 在室温下的超净工作台中，使用手术剪小心地将胚胎从子宫中取出。用镊子去除胚胎上的所有胎盘残留物，并将其放入另一个装有杜尔贝科缓冲液的10 cm培养皿中。
5. 使用解剖镊或针，在图1A中标记的黑箭头位置处，将胚胎头部的后半部分剪下。将剪下的组织与胚胎其余部分分离（图1B）。
6. 将剪下的组织后端朝向观察者（图1C），从尾侧向头侧轻轻纵向剖开（图1D）。从头端开口下方0.5 mm处，切取一个2 mm²–3 mm²的区域，如图1E所示。
7. 收集腹侧中脑底部组织（见图1F），放入一个空的1.5 mL微量离心管中。将微量离心管置于冰上，直至所有中脑底部组织均收集完毕。
   注意：也可在完成所有胚胎脑组织解剖后，使用1 mL移液器收集中脑底部组织。

3. 以96孔板形式建立E13.5小鼠胚胎的原代中脑培养

1. 将所有胚胎的中脑腹侧组织收集至同一支1.5 mL离心管后，去除残留的Dulbecco缓冲液，并用500 μL无Ca²⁺、Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤组织碎片三次。
2. 去除HBSS，向管中加入500 μL 0.5%胰蛋白酶，于37 °C孵育30分钟。
3. 在孵育期间，将1.5 mL胎牛血清（FBS）于37 °C预热，加入30 μL DNase I至FBS中并混匀。同时，将硅化玻璃移液管的管口进行火焰抛光，确保孔口无锐边，且直径与1 mL移液器吸头大小相近。
   注意： 也可选用低吸附性的1 mL移液器吸头进行吹打。然而，硅化玻璃移液管似乎可获得最佳效果。
4. 步骤3.2的孵育一结束，立即向部分消化的组织中加入500 μL FBS/DNase混合液。使用玻璃移液管在FBS/胰蛋白酶混合液中吹打组织，直至组织解离成微小、几乎不可见的颗粒。吹打过程中避免产生气泡。
5. 让残留的组织颗粒依靠重力自然沉降到微量离心管底部。在不吸取底部沉淀物的前提下，将上清液转移至一个空的15 mL锥形聚丙烯管中。
6. 将步骤3.3中配制的FBS/DNase I溶液（98:2）用1,000 μL HBSS稀释，得到FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）混合液。通过反复吹打混匀。向微量离心管中的残留颗粒中加入1,000 μL该新配制的混合液，再次进行吹打，并重复步骤3.5。
7. 重复上一步操作一次，以用尽全部FBS/DNase-I/HBSS（49:1:50）混合液。
8. 当所有上清液均已被收集至15 mL管中（来自步骤3.5、3.7和3.8）后，使用台式离心机以约3 mL体积在100 × g下离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液时注意不要扰动管底的细胞沉淀。
9. 向细胞沉淀中加入2 mL DPM重悬洗涤，于100 × g离心5分钟。弃去上清液，并重复洗涤两次，以最大程度减少沉淀细胞中的碎片。
   注意： 培养神经元时应始终使用新鲜且预热的DPM。洗涤步骤中DPM无需新鲜配制，但应预先加热至37 °C。
10. 用新鲜、预热的DPM稀释细胞，并转移至微量离心管中。稀释所用DPM的体积取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，若使用十个胚胎，则用150 μL DPM稀释所得细胞。
11. 取10 μL含细胞的DPM转移至微量离心管中，与10 μL 0.4%台盼蓝染液混匀。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞（即台盼蓝阴性细胞）。
    注意： 每孔接种30,000个细胞，可获得约每孔1,000个多巴胺能神经元。若细胞密度高于约每6 μL含30,000个细胞，则在接种前需用DPM进一步稀释，确保接种体积不少于6 μL。
12. 不接触孔底，移除步骤1.6中形成的微岛区域内的DPM。
13. 为确保每孔细胞密度一致，在接种前需通过轻柔吹打混匀细胞悬液。使用1–10 μL移液器，将6 μL细胞悬液加至每孔微岛原位置的中央。
14. 向培养板边缘的空孔中加入150 μL水或1× PBS，以减少含神经元培养物孔内的液体蒸发。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。
15. 1小时后，从培养箱中取出培养板，向每孔含细胞的孔中加入100 μL DPM，然后放回培养箱继续孵育。
16. 接种后两天（体外培养第2天，即DIV2），每孔移除25 μL培养基，并加入75 μL新鲜DPM，使最终培养基体积达到150 μL，尽可能减少蒸发。
17. 在DIV5时更换一半培养基（即移除75 μL并加入75 μL新鲜DPM）。DIV5之后不再进行任何换液操作。

4. 利用预先形成的纤维诱导原代胚胎多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集

使用α-突触核蛋白预制纤维（PFFs）进行任何操作后，需先用1%十二烷基硫酸钠（SDS）清洁超净工作台或可能接触过PFFs的设备，再用70%乙醇进行清洁。

1. 实验前，用1×PBS将PFFs稀释至终浓度为100 μg/mL。将稀释后的PFFs置于微量离心管中，使用带有水浴冷却（4 °C）的高功率浴式超声仪进行超声处理，共10个循环，每个循环30秒开启/30秒关闭。
   注意：必须充分超声处理纤维，以产生约50 nm长的片段。超声处理后PFFs的大小可通过染色PFFs的透射电子显微镜图像直接测量。超声处理可按照上述方法在高功率浴式超声仪中完成，也可使用探头式超声仪。超声处理后的PFFs可分装成小份后于-80 °C保存，以避免反复冻融。
2. 在DIV8时，向每孔150 μL培养基中加入3.75 μL浓度为100 μg/mL的PFFs，使终浓度达到2.5 μg/mL。对照组加入等体积的1×PBS。
3. 用1×PBS配制4%多聚甲醛（PFA），分装后于-20 °C保存。操作步骤如下：
   ​注意：PFA具有毒性，配制时需佩戴口罩和手套，在层流罩内操作，并按照机构规定处置所有固态和液态PFA废弃物。
   1. 将500 mL的1×PBS置于1 L容器中预热。将磁力搅拌子放入容器，并将容器置于带加热功能的磁力搅拌器上。调节温度至40–60 °C之间，以防止沸腾同时保持溶液温热。
   2. 在通风橱内，使用一次性塑料量杯称取20 g PFA粉末，小心地将PFA粉末加入盛有1×PBS的容器中，开始搅拌溶液。
   3. 向溶液中加入200 μL 5 M氢氧化钠，并持续搅拌约15分钟，直至PFA完全溶解。
   4. 当溶液呈现均匀状态后，加入168 μL 5 M盐酸以调节pH至约7。使用一次性固定色阶pH试纸检测pH值。
   5. 将容器从加热装置上取下，使其冷却至室温。过滤溶液并分装，于-20 °C保存。使用前在室温下解冻，解冻后不得再次冷冻。
4. 在DIV15时，用移液器吸除各孔中的全部培养基。每孔加入50 μL 4% PFA以固定细胞，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，吸除PFA溶液，每孔加入100 μL 1×PBS洗涤细胞。吸除1×PBS后，再重复洗涤两次。
5. 每孔保留100 μL 1×PBS，以防干燥。将培养板置于4 °C保存，直至进行免疫染色。

5. 在96孔板中对原代胚胎多巴胺神经元进行免疫荧光染色及自动化成像

1. 吸除 1x PBS，每孔加入 100 μL 含 0.2% Triton X-100 的 PBS（PBST）溶液，室温孵育 15 分钟以透化细胞。
2. 吸除 PBST，每孔加入 50 μL 含 5% 正常马血清（NHS）的 PBST 溶液。为阻断非特异性抗原活性，室温孵育 1 小时。
3. 用含 5% NHS 的 PBST 将针对酪氨酸羟化酶（TH）和 pS129-αsyn 的一抗按 1:2,000 比例稀释。每孔加入 50 μL 稀释后的一抗，4 °C 过夜孵育。
4. 吸除一抗溶液，每孔加入 100 μL 1x PBS 洗涤细胞。吸除 1x PBS，重复洗涤 2 次。
5. 为防止荧光分子淬灭，请在最低光照条件下操作。将荧光标记的二抗按 1:400 比例用 PBST 稀释。每孔加入 50 μL 稀释后的二抗，室温孵育 1 小时。
6. 吸除二抗溶液，每孔加入 100 μL 1x PBS 洗涤细胞。吸除 1x PBS，重复洗涤 2 次。
7. 吸除 1x PBS，每孔加入 50 μL 浓度为 200 ng/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以染色培养细胞的细胞核，室温孵育 10 分钟。
8. 用 100 μL 1x PBS 每次 5 分钟，共洗涤细胞 3 次。最后一次洗涤后每孔保留 100 μL 1x PBS。用铝箔包裹培养板，4 °C 保存直至成像。
9. 使用配备 10x 物镜的高内涵板扫描仪（见材料表），在 96 孔观察板中对原代胚胎多巴胺能神经元进行成像。
10. 根据 96 孔板的具体参数（如板类型、生产商、尺寸、孔间距以及培养基类型和体积）调整成像设置。
11. 选择孔内成像区域以覆盖微岛中的所有细胞。选取一个代表性孔进行自动对焦调整，初始对焦基于 DAPI 信号。
12. 根据对照孔中染色强度校准每个荧光通道的采集时间。调整参数，使得在 PFF 处理的对照孔中，可清晰区分细胞胞体中含有 pS129-αsyn 聚集体的多巴胺能细胞，从而能够明确量化 pS129-αsyn 阳性与阴性细胞。
    注意：未添加 PFF 的孔不应出现 pS129-αsyn 染色，因此这些孔可用作调整 pS129-αsyn 信号强度的阴性对照。
13. 使用 10x 物镜，以完全相同的参数同时对所有选定孔的全部荧光通道进行免疫荧光染色成像。
14. 可选：使用特异性识别纤维状 α-突触核蛋白的抗体，对部分孔中的 α-突触核蛋白包涵体进行标记，以确认 pS129-αsyn 阳性包涵体数量的变化反映的是蛋白聚集减少，而非 pS129-αsyn 磷酸化或去磷酸化的抑制。
15. 重复步骤 5.3，将 pS129-αsyn 抗体替换为 α-突触核蛋白纤维抗体（1:2,000）。按照步骤 5.13 对染色的聚集性 α-突触核蛋白进行成像。

结果

图1：从小鼠E13.5胚胎中解剖中脑腹侧板。（A）头部后部的切割位置以黑色箭头和白色虚线标出。（B）该组织块已从胚胎其余部分移除，移除的组织块以圆圈标出。（C）将组织块旋转90°，使尾侧朝向观察者。（D）从黑色箭头处沿白色虚线所示方向，由尾端向头端打开组织。（E）在开口下方0.5 mm–1 mm处，切取2 mm²–4 mm²的区域（以黑色线条标出）。（F）分离出中脑腹侧板（以黑色虚线方框标出）。比例尺 = 1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝染液	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15250061
15 ml CELLSTAR 聚丙烯管	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany	188261
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	培养基配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
5 M NaOH	N/A	N/A	培养基配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
96孔ViewPlate（黑色）	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA	6005182
99.5% 乙醇（EtOH）	Altia Oyj, Rajamäki, Finland	N/A
AquaSil 硅化液	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	TS-42799
高压灭菌的1.5 ml 微量离心管	N/A	N/A	培养基配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
Bioruptor 超声破碎仪	Diagenode, Liege, Belgium	B01020001
无Ca²⁺、Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS）	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	14175-053
CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包	N/A	N/A	免费开源软件
Centrifuge 5702 离心机	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5702000019
CO₂ 培养箱	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	N/A
细胞计数板	BioRad Inc., Hercules, California, USA	1450015
配备气浮台和机柜的DeltaVision超分辨率显微镜	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA	29254706
脱氧核糖核酸酶I（Dnase I）	Roche, Basel, Switzerland	22098700
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21331–020
驴抗小鼠AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A21202
驴抗兔AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A31573
驴抗绵羊AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A11015
Dulbecco缓冲液	N/A	N/A	培养基配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
胎牛血清（FBS）	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10500056
Fisherbrand 普通经济型PTFE搅拌子	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	11507582
ImageXpress Nano 自动成像系统	Molecular Devices, San Jose, California, USA	N/A
L-谷氨酰胺	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	25030–032
小鼠单克隆抗酪氨酸羟化酶抗体	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German	MAB318
N2添加剂	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	17502–048
正常马血清	Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States	S-2000
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	158127
95% 多聚甲醛粉末	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	158127
pH-Fix 色标固定pH指示条	Macherey-Nagel, Düren, Germany	92110
磷酸盐缓冲液（PBS）	N/A	N/A	培养基配制室，赫尔辛基大学生物技术研究所
聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4957
Primocin	InvivoGen, San Diego, California, USA	ant-pm-1, ant-pm-2
兔单克隆抗α-突触核蛋白纤维抗体	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab209538
兔单克隆抗磷酸化丝氨酸129-α-突触核蛋白抗体	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab51253
RCT Basic, IKA 磁力搅拌器	IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany	3810000
重组人胶质细胞源性神经营养因子（hGDNF）	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 或 Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
重组小鼠α-突触核蛋白预形成纤维（PFFs）	N/A	N/A	合作研究者Kelvin C Luk教授惠赠
研究型体视显微镜系统	Olympus Corporation, Tokyo, Japan	SZX10
绵羊多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German	ab1542
TC 20 自动细胞计数仪	BioRad Inc., Hercules, California, USA	1450102
吐温X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	11332481001
胰蛋白酶	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	2199700