研究原代胚胎小鼠多巴胺神经元中的 α-突触核蛋白积累

摘要

来源:Er， S. et al.， 研究原代胚胎小鼠中脑多巴胺神经元中预先形成的原纤维诱导的 α-突触核蛋白积累。J. Vis. Exp. （2020 年）。

该视频演示了量化用 α-突触核蛋白预先形成的原纤维处理的胚胎小鼠多巴胺神经元中 α-突触核蛋白积累的过程。它概述了使用免疫荧光固定、染色和定量含有 α-突触核蛋白聚集体的多巴胺神经元的步骤。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 准备工作

1. 用 0.46% D-葡萄糖、1% L-谷氨酰胺、1% N2、0.2% 初生霉素制备多巴胺神经元培养基 （DPM），用 DMEM/F12 完成。混合成分后过滤 DPM。将 DPM 储存在 4 °C 下，每个等分试样仅加热一次><。 注意:DPM 不应含有神经胶质细胞衍生的神经营养因子 （GDNF），因为它会减少多巴胺神经元中α-突触核蛋白的积累。
2. 准备具有极强疏水性的硅化玻璃移液器，从而在胚胎神经元的初始处理过程中最大限度地减少对表面的附着和细胞的损失。
   1. 将 10 mL 硅化液加入 1 L 蒸馏水中，并在 2 L 容器中搅拌混合。将玻璃移液器浸入硅化溶液中 15 分钟。
   2. 用蒸馏水冲洗移液器 3-5 次。在室温 （RT） 下干燥移液器过夜或在 100-120 °C 加热的无菌空间中干燥 1-2 小时，以加快干燥速度。
   3. 通过在密封的高压灭菌袋中进行标准高压灭菌对移液器进行消毒。
3. 通过在 96 孔板的中间孔中加入 60 μL PO 溶液来制备具有透明底部的聚-L-鸟氨酸 （PO） 涂层的 96 孔板，用于神经元的接种，在板的边缘留下至少一行/一列孔以避免边缘效应。将涂层板在 4 °C 或 RT 下放置 4 小时。
4. 在铺板细胞之前，完全吸出 PO 并用 100 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞三次。从孔中吸出 1x PBS，并保持板盖打开以完全干燥><。 注意:可以收集用过的 PO 并对其进行过滤以供重复使用。对于同一 PO 解决方案，可以重复此作两次。
5. 向先前包被的孔中加入 50 μL DPM。用 100 μL 塑料吸头从孔中吸出 DPM，同时以圆周运动刮擦孔底部，以去除每个孔周边的涂层。一个 PO 涂层的岛将保留在井的中间。
6. 在层流罩下，在每个包被岛的中间添加 10 μL DPM><，以形成微岛。 注意:在细胞分离过程中，带有 DPM 覆盖的微岛的板可以在层流罩下放置 1-2 小时。

2. 从 E13.5 小鼠胚胎中分离腹侧中脑底

注意:中脑地板解剖步骤参见图 1。

1. 解剖前，用 Dulbecco 缓冲液填充 10 厘米培养皿并将其保存在冰上。
2. 根据该机构的指南对 E13.5 怀孕的雌性小鼠实施安乐死。将鼠标平放在其背上，并用 70% 乙醇喷洒前体。用镊子提起子宫上方的皮肤，然后用手术剪刀切开以露出子宫。
3. 小心地取出子宫，并将其放入先前准备好的冰培养皿中。
4. 在 RT 的层层罩下使用手术剪刀，小心地从子宫中取出胚胎。用镊子从胚胎中去除所有胎盘残留物，并将它们放入装有 Dulbecco 缓冲液的新 10 厘米培养皿中。
5. 使用解剖钳或针头，从图 1A 中用黑色箭头标记的地方切下头部的后半部分。将切块从胚胎的其余部分中取出（图 1B）。
6. 将切割块的后部朝向观察者（图 1C），并从尾部到颅部轻轻切开（图 1D）。从颅口下方 0.5 mm 处切出 2 mm^2-3 mm² 区域，如图 1E 所示。
7. 将腹侧中脑底（参见图 1F）收集在一个空的 1.5 mL 微量离心管中。将微量离心管放在冰上，直到所有中脑底部都聚集在其中><。 注意:或者，在解剖所有胚胎脑后，可以用 1 mL 微量移液器收集中脑底。

3. 从 96 孔板格式的 E13.5 小鼠胚胎中建立原代胚胎中脑培养物

在同一根
1. 1.5 mL 试管中收集所有胚胎的中脑底后，去除残留的 Dulbecco 缓冲液，并用 500 μL 不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 洗涤组织块三次。
2. 去除 HBSS 并向试管中加入 500 μL 0.5% 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 孵育过程中，在 37 °C 下加热 1.5 mL 胎牛血清 （FBS），向 FBS 中加入 30 μL DNase I 并混合。此外，对硅化玻璃移液器的尖端进行火抛光。确保孔没有锋利的边缘，并且与 1 mL 微量移液器吸头的大小大致相同><。 注:作为替代方案，可以使用低粘附力 1 mL 微量移液器吸头进行研磨。然而，硅化玻璃移液器似乎给出了最好的结果。
4. 步骤 3.2 中的孵育结束后，立即向部分消化的组织中加入 500 μL FBS/DNase 混合物。使用玻璃移液管研磨 FBS/胰蛋白酶混合物中的组织。研磨直到组织解离成微小的、几乎看不见的颗粒。研磨过程中避免气泡。
5. 让剩余的颗粒在重力作用下沉淀在微量离心管的底部。无需移液底部的沉淀物，将上清液收集到空的 15 mL 锥形聚丙烯管中。
6. 用 1,000 μL HBSS 稀释步骤 3.3 中的 FBS/DNase I （98:2），以获得 FBS/DNase-I/HBSS （49:1:50）。通过上下移液混合。将 1,000 μL 新混合物添加到微量离心管中的剩余颗粒中。再次研磨并重复步骤 3.5。
7. 再次重复上一步以用完所有 FBS/DNase-I/HBSS （49:1:50）。
将所有
8. 上清液收集在 15 mL 试管内（来自步骤 3.5、3.7 和 3.8）后，使用台式离心机以 100 x g 的速度旋转上清液 （~3 mL），持续 5 分钟。去除上清液，不要接触底部的沉淀细胞。
9. 向试管中加入 2 mL DPM 洗涤细胞沉淀，并以 100 x g 的速度旋转 5 分钟。去除上清液并重复洗涤 2 次，以尽量减少沉淀细胞中的碎片><。 注意:始终对培养的神经元使用新鲜、加热的 DPM。对于洗涤步骤，DPM 不必是新鲜的，但应预热至 37 °C。
10. 用新鲜、温热的 DPM 稀释细胞，并将其转移到微量离心管中。用于稀释的 DPM 量取决于用于组织解剖的胚胎数量。例如，使用 150 μL 的 DPM 稀释从 10 个胚胎中获得的细胞。
11. 将 DPM 中的 10 μL 细胞转移到微量离心管中。将它们与 10 μL 的 0.4% 台盼蓝染色剂混合。使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对活细胞（即台盼蓝阴性细胞）进行计数><。 注:每孔使用 30,000 个细胞进行铺板，以获得每孔 ~1,000 个多巴胺神经元。如果细胞密度高于每 6 μL ~30,000 个细胞，则在铺板前用 DPM 进一步稀释细胞，使接种体积不小于 6 μL。
12. 在不接触孔底部的情况下，从步骤 1.6 中创建的微岛中取出 DPM。
13. 为了在每个孔中获得可重现的细胞密度，在孔中铺板之前，通过轻轻移液混合细胞。使用 1–10 μL 微量移液器，将 6 μL 细胞添加到孔中间每个前微岛的位置。
14. 用 150 μL 水或 1x PBS 填充板边缘的空孔，以尽量减少从含有神经元培养物的孔中蒸发。将板在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 1 小时。
15. 1 小时后，从培养箱中取出板，向每个装有细胞的孔中加入 100 μL DPM，然后将其放回培养箱中。
16. 铺板后两天（体外第 2 天或 DIV2），去除 25 μL 并加入 75 μL 新鲜 DPM，使最终培养基体积达到 150 μL，并尽可能避免蒸发。
在
17. DIV5 处用新鲜 DPM 交换一半的培养基（即，去除 75 μL 并加入 75 μL 新鲜 DPM）。请勿在 DIV5 之后执行任何介质更改。

4. 通过接种预先形成的原纤维在原代胚胎多巴胺神经元中诱导 α-突触核蛋白聚集体

在对 α-突触核蛋白预形成原纤维 （PFF） 进行任何工作后，用 1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 清洁层流罩或任何可能与 PFF 接触的设备，然后用 70% 乙醇清洁。

1. 实验前，用 1x PBS 将 PFF 稀释至终浓度为 100 μg/mL。用浴超声仪以高功率对微量离心管中稀释的 PFF 进行超声处理，水浴在 4 °C 下冷却 10 个循环，30 秒开/30 秒关><。 注意:对原纤维进行适当的超声处理以产生 ~50 nm 长的片段至关重要。超声处理的 PFF 的大小可以直接从染色 PFF 的透射电子显微镜图像中测量。如上所述，可以在高功率浴超声仪中实现超声处理。或者，可以使用 Tip 超声仪。超声处理的 PFF 可以在 -80 °C 下以小等分试样储存，以避免多次冻融循环。
2. 在 DIV8 上，每孔向孔中的 150 μL 培养基中加入 3.75 μL 100 μg/mL 的 PFF，至终浓度为 2.5 μg/mL。对对照组使用相同量的 1x PBS。
3. 在 1x PBS 中制备 4% 多聚甲醛 （PFA），并将等分试样储存在 -20 °C。为此，请按照以下步骤作。
   注意:PFA 有毒;准备过程中戴上口罩和手套，始终在层流罩下工作，并按照机构的指示处理所有固体和液体 PFA 废物。
   1. 在 1 L 容器中加热 500 mL 的 1x PBS。在容器中放置搅拌棒，并将容器放在具有加热功能的磁力搅拌器上。在 40–60 °C 之间调节温度，以防止沸腾，同时保持溶液温暖。
   在
   2. 一次性塑料测量容器中的引擎盖下测量 20 克 PFA 粉末。小心地将 PFA 粉末加入装有 1x PBS 的容器中。开始搅拌溶液。
   3. 向溶液中加入 200 μL 5 M 氢氧化钠，继续搅拌 ~15 分钟，直到 PFA 完全溶解。
   4. 溶液均匀后，加入 168 μL 5 M 氯化氢，使 pH 值平衡至 ~7。使用一次性彩色固定 pH 试纸检查 pH 值。
   5. 从加热器中取出容器，使其冷却至 RT。过滤溶液并分装以在 -20 °C 下储存。使用前在 RT 中解冻等分试样，之后不要重新冷冻。
4. 在 DIV15 上，通过移液从孔中去除所有培养基。向每个孔中加入 50 μL 4% PFA 以固定细胞并在室温下孵育 20 分钟。孵育后，从孔中取出 PFA，并向每个孔中加入 100 μL 1x PBS 以洗涤细胞。去除 1 x PBS 并再洗涤 2 倍。
5. 在每个孔中留下 100 μL 的 1x PBS 以避免干燥。将板储存在 4 °C 直至进行免疫化学。

5. 96 孔板中原代胚胎多巴胺神经元的免疫荧光染色和自动成像

1. 通过每孔添加 100 μL 0.2% Triton X-100 的 PBS （PBST） 溶液并在 RT 下孵育 15 分钟，去除 1x PBS 并透化细胞。
2. 去除 PBST，每孔向 PBST 中加入 50 μL 5% 正常马血清 （NHS）。为了阻断非特异性抗原活性，请在 RT 下孵育 1 小时。
3. 在 PBST 中的 5% NHS 中稀释针对酪氨酸羟化酶 （TH） 和 pS129-αsyn （1:2,000） 的一抗。向每个孔中加入 50 μL 稀释的抗体，并在 4 °C 下孵育过夜。
4. 去除抗体并向每个孔中加入 100 μL 1x PBS 以洗涤细胞。取出 1 x PBS 并重复洗涤 2 次。
5. 为防止荧光分子漂白，请在最低光照条件下开始工作。在 PBST 中稀释荧光标记的二抗 （1:400）。向每个孔中加入 50 μL 稀释的抗体，并在 RT 下孵育 1 小时。
6. 取出抗体溶液，向每个孔中加入 100 μL 1x PBS 以洗涤细胞。取出 1 x PBS 并重复洗涤 2 次。
7. 去除 1x PBS，每孔加入 50 μL 200 ng/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对培养细胞的细胞核进行染色，并在 RT 下孵育 10 分钟。
8. 用 100 μL 1x PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。最后一次洗涤后，在每个孔中保留 100 μL 的 1x PBS。用铝箔覆盖板并将其储存在 4 °C 直至成像。
9. 使用装有 10 倍物镜的高内涵板扫描仪（参见材料表）在 96 孔视图板中对原代胚胎多巴胺神经元进行成像。
10. 根据 96 孔板的规格调整设置，例如板类型、制造商、大小、孔之间的距离以及培养基的类型和数量。
11. 选择孔的成像区域以覆盖微岛中的所有细胞。选择一个示例井来调整自动对焦。将最初的重点建立在 DAPI 上。
12. 根据对照孔中染色的强度校准每个荧光通道的采集时间。调整参数，以便在 PFF 处理的对照孔中，可以清楚地区分细胞体中含有 pS129-αsyn 聚集体的多巴胺细胞，从而可以明确定量 pS129-αsyn 阳性和 pS129-αsyn 阴性细胞><。 注意:不含 PFF 的孔不应有任何 pS129-αsyn 染色;因此，这些孔可用作调节 pS129-αsyn 强度的阴性对照。
13. 用 10 倍物镜同时对所有通道进行免疫荧光染色，以完全相同的参数对所有选定的孔进行成像。
14. 可选地，用丝状 α-突触核蛋白特异性抗体标记孔子集中的 α-突触核蛋白包涵体，以确认 pS129-αsyn 阳性包涵体数量的变化反映了蛋白质积累的减少，而不是抑制 pS129-α syn 的磷酸化或去磷酸化。
15. 重复步骤 5.3，用 α-突触核蛋白丝抗体 （1:2,000） 替换 pS129-αsyn 抗体。如步骤 5.13 所示，对染色的聚集α突触核蛋白进行成像。

结果

图 1:从 E13.5 小鼠胚胎中解剖中脑底。（A） 头部后躯的切割位置用黑色箭头和白色虚线标记。（B） 从胚胎的其余部分取出该碎片。移除的棋子被圈出。（C） 将作品旋转 90°，使其面向观察者的后部。（D） 该块从黑色箭头打开，从尾部到颅骨（用白色虚线标记）。（E） 从开口下方 0.5 mm–1 mm 处，切割 2 mm²–4 mm² 区域（用黑线标记）。（F） 腹侧中脑底被隔离（用黑色虚线方块标记）。比例尺 = 1 毫米。

材料