在幼年大鼠中建立大脑中动脉阻塞以诱导局灶性脑缺血

摘要

来源：Larpthaveesarp, A.，等．P10大鼠新生期卒中短暂性大脑中动脉闭塞模型．J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了在幼年大鼠中建立大脑中动脉闭塞模型的过程。暴露颈内动脉（ICA），并结扎以限制血流。通过颈内动脉插入阻塞物，使其到达大脑中动脉。随后让幼鼠恢复，再进行进一步分析。

方案

涉及动物模型的所有操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会审核。

1. 大脑中动脉闭塞

1. 称量幼鼠，确保其体重在正常范围内（19–21 g）。使用3%异氟烷与100%氧气（O₂）对幼鼠进行麻醉，并确认其对足部夹捏无反应。通过在手术台下方使用加热垫，维持幼鼠体表温度在35.5 °C至37 °C之间。
2. 用胶带固定幼鼠肩部区域，使其保持仰卧位。使用无菌棉签，先以聚维酮碘溶液擦拭颈部前侧区域，再用70%乙醇（溶于双蒸水）棉签擦拭，两种溶液交替使用，共擦拭四次。
3. 在预定切口部位局部浸润0.25%布比卡因。在体视显微镜下，沿中线做5至7 mm的颈部前侧切口，暴露颈总动脉（CCA）。放置2–4个牵开器，以保持术野开放并充分暴露动脉。
4. 定位颈内动脉（ICA）、枕动脉（OA）和颈外动脉（ECA）。清理动脉周围组织，获得清晰视野。注意避免扰动迷走神经。
   注意：对于假手术组幼鼠，切口保持开放，暴露动脉后即缝合关闭切口。总麻醉时间应与闭塞手术组相当。
5. 剪取1.5 cm长的6-0编织丝线缝合线。将缝合线拆解，抽出单股细丝。确保单股细丝整齐、无毛边。
   注意：如有必要，可将单股细丝末端浸入无菌水中，再用镊尖整理，以平滑毛边。
6. 用45度角镊子夹住缝合细丝，以弧形扫动方式从颈内动脉（ICA）下方穿过，使镊尖出现在ICA与OA之间。
   注意：若解剖操作得当，此步骤应相对容易。若ICA与OA紧贴，使用镊子分离ICA时需小心，避免刺破动脉。若发生出血，用镊子轻压出血部位直至止血，并用无菌棉签吸除血液。
7. 用镊子夹住已被镊子穿过的缝合细丝末端并拉出，使其易于操作。松开镊子夹持，将镊子沿步骤1.5的反向动作从ICA下方退出（图1A）。
8. 在ICA根部（即靠近其从CCA分叉处）打一个临时结扎结。
   注意：打结时应确保用于抽松结扎的线头长度适中（大于1 mm，小于3 mm），以便镊子轻松夹持，同时保证结的另一侧留有足够长度的线段用于牵拉。
9. 小心将ICA向侧方牵拉，并使用夹子将牵拉线固定于切口对侧腋区附近的多余皮肤上。确保牵拉线张力足够，在进入下一步前阻断血流，以最大限度降低不可控出血风险。观察动脉应呈扁平、苍白状态。
   注意：避免过度牵拉，以防ICA部分或完全撕裂。可在动脉切开前，通过拉动夹子对侧的牵拉线来微调牵拉程度。
10. 使用45°镊子夹取另一股拆解后的缝合细丝，按步骤1.5的方法从ICA下方穿过并绕行一周。将此线段置于牵拉线的外侧（图1B）。
    注意：此步骤也可在牵拉前完成。若对牵拉效果不确定，可在下一步前将此结非常松地打上。
11. 在已结扎与未结扎线结之间的中点处，切开0.2 mm长的动脉切口，位置略靠近已结扎线结一侧。
    注意：结扎段动脉内残留的血液可能从切口流出，但不应超过5 µL。若持续出血，可小心拉紧牵拉线以增强牵拉，但需避免因张力过大而损伤动脉。
12. 使用刻度尺测量阻塞用缝线，并额外预留2–3 mm长度后剪断，以便在再灌注时取出阻塞物。用45度角镊子夹持阻塞线，用直镊在适当位置弯折，使线端达到大脑中动脉（MCA）的预定位置，作为推进的止点标记。
    注意：对于该体重范围内的出生后或P-10期Sprague Dawley或Long Evans幼鼠，从硅胶头端至弯折处的阻塞长度通常为10 mm。
13. 使用45°镊子将带硅胶涂层的尼龙阻塞缝线经动脉切口送入，并推进至标记MCA预定距离的弯折处（图1C）。推进过程中应感觉顺畅；若遇阻力，应立即停止推进。推进方向应与颈总动脉/颈外动脉（CC/ECA）平行，朝向头部。
    注意：若缝线向背侧推进靠近动物脊柱，可能进入翼腭动脉（PTA）。若推进3–5 mm后即遇阻力，提示缝线已抵至PTA分叉处。此时应将阻塞物从动脉中稍许退出，使硅胶头端接近动脉切口，再调整推进方向。无需将阻塞物完全撤出动脉切口。
14. 使用步骤1.10中的缝线，打临时结扎结以固定阻塞物（图1D）。
15. 移除牵开夹。修剪两个临时结扎线的线头，使用于抽松结扎的线头长度适中，便于直镊夹持，且长于用于收紧结扎的线头。
    注意：线头应足够短，以防切口闭合后在术腔内缠绕。
16. 移除牵开器，使用6-0编织丝线行3至4个间断缝合，关闭术腔。
17. 将幼鼠移出麻醉环境，置于室温空气中的加热垫上。密切监测幼鼠，直至其恢复足够意识以维持胸卧位，并确认其完全恢复后再放回母鼠身边。确保幼鼠体表温度维持在35.5 °C至37 °C之间。

结果

图1：tMCAO 手术过程的实时图像。 （A）第一根缝线环绕颈内动脉（ICA），如步骤1.6所述。（B）打结第一根临时结扎线，并将ICA牵拉。第二根缝线在第一根缝线外侧环绕ICA，如步骤1.9所述。（C）将硅胶包被的阻塞缝线插入动脉切开部位，如步骤1.12所述。（D）打结第二根临时结扎线以固定阻塞物，如步骤1.14所述。比例尺 = 1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Henry Schein	50033	麻醉剂，使用浓度为 3%
三目手术显微镜	World Precision Instruments	PSMT5N
加热垫	Sunbeam	000731-500-000	低至中等档位
红外测温仪	Extech Instruments	72-5270
小型动物牵开器套装	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut 剪刀	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF 镊子	Fine Science Tools	112522-00	2个
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35	2个
B-2 微型夹钳	Fine Science Tools	00398-02
用于夹钳操作的持钳器	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas 剪刀	Fine Science Tools	15000-03	2 mm 刃口
阻断缝合线	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
尺子	Fine Science Tools
6-0 Perma-Hand 丝线反向切割缝合线	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
棉签	Henry Schein	100-9249
实验室胶带	VWR	89097-990