使用一次性微流控芯片捕获CD4+ T淋巴细胞用于HIV研究

方案

1. 制备具有抗 CD4⁺ 生物素化表面的微流控通道。
2. 使用注射泵以 5 ml/min 的流速向微流控通道中注入 10 ml 样本血液。
3. 以 20 ml/min 的流速用 PBS 冲洗血液，持续 20 分钟。
4. 以 5 µl/min 的流速注入稀释后的 FACS 裂解液（用 PBS 将原液稀释至 10%），持续 15 分钟。
5. 孵育 15 分钟。
6. 以 5 ml/min 的流速注入初级 CD3⁺ 抗体溶液（用 PBS 将原液稀释至 10%），持续 20 分钟。
7. 孵育 2 小时。
8. 以 5 ml/min 的流速用 PBS 冲洗通道，持续 15 分钟。
9. 同时以 5 ml/min 的流速注入 20% AF488 CD4⁺ 抗体、0.2% DAPI 原液以及 10% 二抗 CD3⁺ 抗体，持续 20 分钟。
10. 孵育 20 分钟。
11. 以 5 ml/min 的流速用 PBS 冲洗通道，持续 15 分钟。
12. 在荧光显微镜下计数细胞：
    1. 白光（光学）— 黑白图像：细胞和灰尘
    2. 紫外光（DAPI）— 蓝色：仅细胞
    3. 蓝光（CD4⁺）— 绿色：T 淋巴细胞和单核细胞
    4. 绿光（CD3⁺）— 红色：仅 T 淋巴细胞

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS 微通道				由SU-8模具制备
血液				来自正常人类受试者的献血。麻省总医院，10倍高密度白细胞或布莱根妇女医院’医院
PBS	缓冲液	Invitrogen	14190	1x 达尔伯克’磷酸盐缓冲液。
FACS 溶血溶液		BD 生物科学	349202	用PBS将储备液稀释至10%。
抗CD4+生物素标记抗体		贝克曼库尔特公司	IM0704	用PBS/BSA将储存液稀释10倍制备表面，其中储存液由0.2 mg储存品与1 ml去离子水混合后，再与生物素标记的抗CD4+抗体混合而成。
山羊抗人CD3δ	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	用 PBS 将原液稀释至 10%
兔抗山羊IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	二抗（抗CD3抗体），用PBS将储备液稀释至10%
抗人 CD4+		BD 生物科学	557695	Alexa Fluor 488 标记，用 PBS 将储备液稀释至 20%
DAPI		Invitrogen	D1306	4’6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐溶液，用PBS稀释至0.2%（由原液稀释）