从人外周血制备富血小板血浆

摘要

来源：
Sathish Muthu^1,2,3

¹印度哥印拜陀骨科研究组。

²卡帕甘高等教育学院工程学院生物技术系。

³政府医学院骨科系。

本视频演示了通过检测血小板计数、采集血液并离心分离血小板，制备高质量富血小板血浆（PRP）的方法。该 PRP 可用于组织再生与修复的治疗应用。

所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际的人体福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 样本采集

使用初步血常规检测对患者进行筛查，以排除血小板减少症并建立基础细胞计数。为此，使用临床级血细胞计数仪进行细胞计数，确保血小板计数高于 150,000 个细胞/µL。
在采集样本前确保患者充分水化。可通过观察舌象、皮肤弹性及测量血压来确认水化状态。
使用两个预先加入 5 mL 酸性枸橼酸葡萄糖腺嘌呤（ACDA）抗凝剂（抗凝剂与血液比例为 1:10）的 50 mL 注射器，从患者的肘前静脉采集 100 mL 外周静脉血。采集后将注射器倾斜，使抗凝剂充分混匀，防止血液样本在进入下一步前发生凝固。
注意：采血速度过慢可能导致血液与抗凝剂混合不充分并引发凝血；因此，采血时应使用至少 18G 的套管针。
将注射器中的 100 mL 血液转移至 15 mL 圆底离心管中，每管加入 10 mL。

2. 离心与分离

将离心管置于室温、无菌环境下的医用级台式离心机中，以 100 × g 的速度进行初次低速离心，持续 15 分钟。抗凝血液将分为三层，即底部的红细胞层、顶部的血浆层以及中间的白膜层。
使用 18G 无菌脊髓穿刺针，以无菌操作方式吸取三层样本的上层液体，并转移至另一个锥底离心管中。每收集 10 mL 血浆，应确保使用单独的离心管。
注意：是否包含白膜层取决于所要分离的富血小板血浆（PRP）类型，而该类型又由其临床应用需求决定。若目标产物为贫白细胞 PRP，则不应包含白膜层；若目标产物为富白细胞 PRP，则在第二次离心前应一并吸取上层血浆和白膜层。
将收集的血浆分装至 15 mL 离心管中，每管含 10 mL 血浆，进行高速离心，条件为 1600 × g 离心 20 分钟。血小板将沉淀于试管底部形成细胞团。将上清液转移至另一离心管中保存。
借助 18G 无菌脊髓穿刺针，将血小板沉淀物吸入 5 mL 注射器中。将所有含沉淀物的试管内容物收集至同一支 5 mL 注射器中，以备后续使用。
根据临床应用所需体积，用第二次离心后所得的上清血浆重新悬浮所收集的沉淀物。

3. 验证

将制备完成的终末富血小板血浆（PRP）置于临床级血细胞计数板中进行细胞计数，计算PRP中的血小板计数、绝对血小板数量、相对于基线的血小板浓度梯度以及本方案的血小板回收效率，计算公式如下。
绝对血小板计数 = PRP 中的血小板计数 µL 1000 倍 PRP 体积（mL）
血小板浓度梯度 =
血小板回收效率 =
例如，100 mL 血液的基线血小板计数为 200,000 / µL 用于PRP制备，最终获得5 mL血小板计数为3,000,000 / µL 获得。上述参数的计算方法如下：
血小板绝对计数 = 3,000,000 × 1000 × 5 = 150亿个血小板
血小板浓度梯度 = 3,000,000 / 200,000 = 15
血小板回收效率 = 3,000,000 × 1000 × 5 / 200,000 × 1000 × 100 = 75%
通过重复循环确保该方案的回收效率。所采用的有效方案可提供超过基线5倍以上的浓度梯度。 >80% 回收效率。根据所需 PRP 体积的用途，可相应地滴定需递送的血小板计数。

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