一种用于小鼠颅内异种移植研究的简易导向螺钉法

摘要

为了评估胶质瘤治疗的新疗法模式，需要建立生理相关性高的模型。我们采用一种可植入式导向螺钉技术建立颅内异种移植模型，该方法比立体定向技术更快速、更安全。

摘要

将人源肿瘤细胞移植到免疫抑制小鼠脑内是研究包括胶质母细胞瘤（胶质瘤）和髓母细胞瘤在内的脑癌的成熟方法。常用的立体定位法每次只能对单只动物进行注射，操作繁琐、劳动强度大，且需要高度专业化的设备。最初由Lal et al.¹开发的导引螺钉法旨在消除复杂的立体定位操作。本文描述了一种改进的导引螺钉方法，具有快速且高度安全的特点，这两点均为重要的伦理考量因素。值得注意的是，我们的操作流程现已结合输注泵，可同时对多达10只动物进行肿瘤细胞注射。

为了验证该方法的实用性，我们在小鼠体内建立了人源U87MG胶质瘤颅内异种移植模型，并使用AMG102进行治疗；AMG102是一种全人源抗体，靶向肝细胞生长因子（HGF）/散射因子，目前正处于临床评估阶段^2-5。系统性注射AMG102显著延长了所有携带颅内U87MG异种移植瘤小鼠的生存期，并实现了多例完全治愈。

本研究表明，导向螺钉法是一种经济且高度可重复的建立颅内异种移植模型的方法。此外，该方法为验证治疗脑癌的新型治疗策略提供了一个相关的生理学模型。

方案

1. 细胞系

1. U87MG 胶质瘤细胞在大规格组织培养瓶中培养，培养基为添加 5% 胎牛血清（FBS）的 DMEM-F12 培养基。
2. 通过用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养瓶两次，然后加入含 0.25% 胰蛋白酶和 0.05% EDTA 的 10 ml PBS，于 37°C 孵育 5 分钟使细胞脱落。细胞脱落后，将其转移至含 10 ml 培养基的 50 ml 离心管中，离心（300 ×g，4 分钟）。
3. 洗涤后，将细胞重悬于培养基中，浓度为 10 × 10⁶/ml，以便接种时每 5 μl 含 50,000 个细胞。
4. 细胞在冰上保存，直至进行颅内注射。

2. 颅内导向螺钉固定

此操作可在细胞注射前数天进行。此处描述的所有操作均在严格无菌条件下进行。

1. 小鼠（BALB/c nu/nu 雌性；5-6 周龄；体重约 18 g）编号以用于识别，称重后通过腹腔（IP）注射给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）混合物进行麻醉。
2. 用碘溶液擦拭皮肤，在颅中线右侧、耳间线前方做一长约 2-3 mm 的小切口，暴露颅骨的冠状缝和矢状缝。前囟位于这两条缝的交界处。
3. 在前囟外侧 2.5 mm、前方 1 mm 处标记导引螺钉的植入位点，该位置正对尾状核上方¹。
4. 使用无菌手持旋转钻头在颅骨上钻出一个深约 1 × 1 mm、直达硬脑膜的孔。
5. 将一根已灭菌的导引螺钉 （其长度可延伸至颅骨表面以下 1.6 mm，进入硬脑膜） 用螺丝刀旋入钻孔，直至与颅骨表面齐平（图 1A）。
6. 将一根无菌的堵头针或假芯插入导引螺钉的中央孔中，封闭开口（图 1B）。
7. 使用 Vetbond 组织胶（正丁基氰基丙烯酸酯）闭合伤口，并通过腹腔注射给予小鼠逆转剂（小动物用）（0.1 ml/kg）和卡洛芬（5 mg/kg/100 μl）以缓解疼痛。随后将小鼠置于加热垫（36°C）上恢复，恢复时间可达 20 分钟。在此期间需频繁监测和观察小鼠状态，直至其完全清醒。

3. 颅内细胞移植

1. 通过在针尖处安装一个小的塑料套环，制备无菌套管式 Hamilton 注射器，使针头仅从导螺钉出口下方伸出 2 mm（图 1B）。因此，最终接种点位于颅骨表面下方 3.5 mm 处。
2. 导螺钉手术后第四天，小鼠再次按前述方法（2.1）进行麻醉，并在导螺钉上方做一小切口以移除针芯。
3. 随后用 5 μl 充分混匀的细胞悬液填充套管式 Hamilton 注射器，注意避免产生或吸入任何气泡。
4. 将注射器固定于灌注泵上，并将针头插入导螺钉中（图 1C）。细胞以每小时 30 μl 的速率注入。
5. 自动化装置（图 1D）使我们能够以恒定流速同时对多达 10 只动物进行注射。也可手动注射：使用套管式 Hamilton 注射器，或用剪去 3 mm 的 200 μl 移液器吸头作为套管，使针尖从导螺钉下方伸出 2 mm。注射过程必须以恒定且平稳的速度进行。
6. 输注完成后，小心拔出注射器，并将针芯重新插入导螺钉中。伤口用胶封闭，小鼠按之前方案（2.7）给予恢复期药物，并置于加热垫上恢复。

4. 治疗性挑战

1. U87MG 细胞接种后第四天，对小鼠进行称重，并随机分为对照组和治疗组。
2. 对照组给予腹腔注射 PBS（100 μl），治疗组给予腹腔注射 AMG102（100 μg 溶于 100 μl PBS 中）。
3. 每两天重复注射一次，持续 14 天，共注射 6 次（图 2）。
4. 末次注射后，每天监测小鼠状态，并每两天称重一次。
5. 当小鼠出现明显神经系统功能障碍（平衡障碍、瘫痪）、脱水、体重减轻超过 10% 或濒死状态时，实施人道安乐死。这些人道终点时间点随后记录于 Kaplan-Meier 生存曲线中。

5. 治疗效果的评估

1. 使用 Windows 版 GraphPad Prism 4.03（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com³）绘制 Kaplan-Meier 生存曲线。将死亡或实施安乐死的动物标记为终点事件，记为 1；实验结束时仍存活的动物记录为非事件，记为 0。

6. 代表性结果：

对照组动物在初次接种细胞后23天开始出现神经系统紊乱和体重减轻的迹象。而AMG102治疗组的该时间点显著延迟至35天。事实上，在第35天时，对照组已有77%（n = 7/9）的动物被实施安乐死。Kaplan-Meier生存曲线清楚地表明，AMG102治疗显著延长了生存时间（图3）。到第70天时，对照组中88%的小鼠已被安乐死（n = 8/9），而AMG102治疗组中仅为37%（n = 3/8）。对脑组织的组织学分析证实，对照组全部9只动物均形成了肿瘤，而AMG102治疗组8只小鼠中仅有3只出现肿瘤（图4）。

图1： 图像（A）显示颅内导向螺钉被放置于尾状核正上方区域。将套管式Hamilton注射器（预先装载细胞）插入导向螺钉内，使针头伸出导向螺钉2 mm，并将细胞注入尾状核内3.5 mm深处。随后取出注射器，并替换为闭塞针（B）。自动输注装置（C）可同时对多达10只动物进行注射。图中显示正在进行五例同步注射（D）。

图2： 研究方案示意图。于第0天注射细胞，第4天开始治疗。对照组动物腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS，100 μl），治疗组动物腹腔注射AMG102（100 μg/100 μl）。每两天注射一次，持续10天，共注射6次。随后对动物进行70天的监测，观察其神经系统和身体异常表现。

图3： 对照组与AMG102处理小鼠的Kaplan-Meier生存曲线比较。经AMG102处理后，小鼠生存率显著提高（p=0.005）。

图 4： 冠状面脑切片的显微照片，显示对照组动物中出现肿瘤形成（A），而AMG102处理组动物中未见脑肿瘤形成（B）。比例尺为 1 mm。

讨论

本文介绍的颅内导向螺钉法能够快速且可重复地建立颅内异种移植模型，在经过培训的动物技术人员操作下，无需使用立体定位仪即可轻松完成该手术。我们的方法结合了导向螺钉的使用，可精确定位最适合体内肿瘤生长的脑区，同时采用自动化输注泵，可实现一次对多达10只动物同时接种。导向螺钉辅助手术的操作时间少于5分钟。以30 μl/小时的速度通过自动化泵输注细胞，完成5 μl体积仅需10分钟。这可确保以恒定速率精确给药，并降低因颅内压升高导致细胞反流至颅外区域的风险。我们还尝试了10 μl体积的输注，未观察到因细胞反流引起的颅外肿瘤生长。由于自动化输注泵支持多只动物同时接种，每小时最多可完成60只动物的注射，而传统立体定位手术每小时仅能处理约15只动物。

该操作中最关键的步骤是颅骨上导引螺钉的位置，因为其位置决定了肿瘤主体的最终位置。如果导引螺钉过于靠中线，细胞将被注入大脑两个半球之间的区域；而如果导引螺钉过于靠前，细胞则根本不会进入脑组织。因此，必须尽可能准确地将导引螺钉定位在前囟（bregma）外侧2.5 mm、前方1 mm处¹。本研究中我们使用了钢制导引螺钉，但对于需要进行脑部成像（如MRI或PET）的研究，也可选用塑料导引螺钉⁶。即使自动输注泵对某些实验室而言成本过高，该方法仍可手动完成，且注射速度仍快于传统的立体定位方法。总体而言，这种快速、准确且可重复的方法可用于胶质瘤、髓母细胞瘤及脑干肿瘤的研究⁷。本操作已在我们两个实验室累计完成超过500只小鼠，死亡病例仅由意外麻醉反应引起（<1%）。使用导引螺钉固定并接种细胞的小鼠未因该操作而死亡或出现任何神经系统并发症。动物术后存活超过100天且无任何并发症。尽管我们倾向于使用无毛小鼠，但只要在手术前去除颅骨部位的毛发以保持术区清洁并防止毛发干扰导引螺钉固定，免疫缺陷且有毛的小鼠（如SCID小鼠）同样适用。

目前有多种新型疗法正在研发中，用于胶质瘤的治疗^8-10。近期我们发现，皮下接种的U87MG胶质瘤异种移植瘤可通过AMG102治疗得到抑制³；AMG102是一种靶向HGF的人源化抗体，目前正处于胶质瘤临床评估阶段⁵。我们采用本文所述方法在裸鼠脑内建立了颅内U87MG肿瘤模型。本研究明确证实了该方法的实用性，并表明AMG102可显著抑制原位U87MG异种移植瘤的生长。我们将继续利用该模型，探索哪些其他疗法可与AMG102联合使用，以实现对肿瘤生长更有效的抑制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Invitrogen	12634010
FCS	Bovogen	SFBS
胰蛋白酶	Invitrogen	15050065
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Balb/c nu/nu 小鼠	ARC Perth
螺丝固定器	Plastics One	SD-1
钻头夹持器	Plastics One	DH-1
钻头	Plastics One	D#60
金属螺丝导向器	Plastics One	C212SG
螺丝假体（触针）	Plastics One	C212SD
Hamilton 注射器（10 μl 26g 固定针头）	Grace Division Discovery Science	80075
PHD 22/2000 注射泵	Harvard Apparatus	70-2003	可选
Vetbond	3M	1469SB
加热垫	Harvard Apparatus	340390