清醒大鼠中用于精确定位神经活动的紧密细胞记录与染色技术

摘要

来源：Moore, J. D., 等. 在清醒、头部固定的大鼠皮层下脑结构中对单个神经元进行细胞外邻近记录与定位. J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了在固定且清醒的大鼠中进行细胞外邻近记录与染色的方法。该过程包括记录神经元信号并注射染料，以精确定位记录位点。该技术可实现神经活动与脑解剖结构之间的精确对应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 神经元单位的紧密细胞外监测

1. 使用二氧化碳激光微管拉制仪（见材料部分）拉制石英毛细管，使其尖端直径小于1 μm（图2A).
   注意： 加热参数将根据具体仪器而有所不同，所需颈部直径也会因目标脑区结构而异。在大鼠丘脑记录时，微电极的颈部长度范围为5-7 mm。
2. 将移液管固定在配有长工作距离物镜的微分干涉差显微镜下。使用建模用黏土将移液管固定在显微镜载物台上。
3. 缓慢地用移液管尖端将一块玻璃片（厚度为0.5–1 cm；使用超薄切片刀制作用的玻璃片较为方便）移入视野中。利用载物台微操作器，轻轻使移液管尖端接触玻璃片，使其断裂。重复此操作，直至移液管尖端外径达到1–3 μm（图2B、C）。确保这些微电极的阻抗在约5-15 MΩ之间。
4. 配制细胞外盐溶液（135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl₂）₂，1 mM MgCl₂，5 mM HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.2），并加入 2%（w/v）芝加哥蓝。使用带有 30 G 或更小针头的注射器将溶液注入玻璃微电极后端。或者，对于单细胞近胞标记，可用 2%（w/v）神经生物素或生物素化葡聚糖胺（BDA....

结果

图1：实验夹具。用于电生理和行为监测实验的大鼠机械夹具示意图。该夹具利用杆和板

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮盐酸盐（Ketaset）	Fort Dodge	N/A
阿奈赛（赛拉嗪溶液）	Lloyd Laboratories	N/A
聚维酮碘（Povidone-Iodine）	CVS 药房	269281
Loctite 495	格雷格工业供应公司	4KL86	20-40 cp 氰基丙烯酸酯
Vetbond	3M	1469SB
握力水泥粉	Dentsply Intl	675571	记录室的底部
握力水泥液	登士柏国际	675572	记录室的底部
硅凝胶	道康宁	3月-80
喷射型义齿修补丙烯酸粉末	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	用于将头部固定装置固定到颅骨上
Ortho-Jet 快速固化正畸用丙烯酸树脂液	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	用于将头部固定装置固定到颅骨
芝加哥蓝	Sigma	C8679
多聚甲醛	Sigma	158127	用于灌注和组织固定
磷酸盐缓冲液	Sigma	P3813	用于灌注和组织固定
细胞色素C	Sigma	C2506
二氨基联苯胺	Sigma	D5905
大鼠袜套	Sew Elegant（加利福尼亚州圣地亚哥）	N/A
PVC 管 2 ½”	美国塑料公司	34108
微型 D 型针脚 & 插座	TE Connectivity	205089-1
直径0.010英寸不锈钢琴钢丝	Precision Brand Products, Inc.	21010
立体定位固定架	Kopf Instruments	Model 900
立体定位耳杆	Kopf Instruments	Model 957
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 960
½ mm 钻头磨头	Henry Schein	100-3995
静音型牙科钻机	中西部牙科	393-1600
不锈钢 0-80 1/8 英寸螺丝	紧固件超级商店	247438
0.2 mL 离心管	Fisher Scientific	05-407-8A
定制头部固定杆	加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间	N/A
直角术后夹	纽波特	MCA-1
8-32 3/4英寸螺钉	Fastener Superstore	240181
4-40 ¼英寸螺钉	紧固件超市	239958
石英毛细管	Sutter Instruments	QF-100-60-10
电动显微操作器	Sutter Instruments	MP-285
微电极放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B	替代部件：Molecular Devices Axoclamp 900A
微电极放大器探头级	Molecular Devices	CV-7B	替换部件：HS-9Ax10 与 Molecular Devices Axoclamp 900A 配合使用
独立脉冲刺激器	A-M Systems	Model 2100	替代部件：HS-9Ax10 与 Molecular Devices Axoclamp 900A 配合使用
音频监视器	Radio Shack	32-2040
电极导联线	导丝	NEF34-1646
放大器头级继电器	COTO Technology	#2342-05-000	（可选）与定制印刷电路板（UCSD Physics Electronics Shop）配合使用，见图6A-C
数码摄像机	巴斯勒	A602fm
移液器架	Warner Instruments	#MEW-F10T
定制头部固定板	加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间	N/A