近细胞记录和染色，用于精确定位清醒大鼠的神经活动

摘要

资料来源：Moore， J. D.， et al. 警觉、头部束缚大鼠皮层下大脑结构中单个神经元的近细胞监测和定位。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频演示了在克制、清醒的大鼠中进行近细胞记录和染色的方法。该过程包括记录来自神经元的信号并注射染料以精确定位记录位点。该技术可以将神经活动准确映射到大脑的解剖结构。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1.神经元单位的近细胞监测

1. 在尖端直径小于 1 μm 的二氧化碳激光微量移液器拉拔器（参见材料部分）上拉动石英毛细管（图 2A）.
   注意：加热参数将根据特定仪器而变化，并且所需的颈部直径将根据感兴趣的大脑结构而变化。对于大鼠丘脑中的记录，微量移液器的颈部范围为 5-7 毫米。
2. 在配备长工作距离物镜的微分干涉对比 （DIC） 显微镜下将移液器固定到位。使用建模粘土将移液器固定在显微镜载物台上。
3. 用移液器吸头缓慢地将玻璃块（0.5 - 1 cm 厚;一块用于制作超薄切片刀的玻璃很方便）移动到视野中。使用载物台显微作器，将移液器吸头轻轻接触玻璃，使其破裂。根据需要重复，直到移液器吸头外径在 1-3 μm 之间（图 2B、C）。确保这些微量移液器的阻抗在大约 5-15 MΩ 之间。
4. 制备细胞外盐水（135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、5 mM HEPES（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸），pH 7.2，含 NaOH）并加入 2% （w/v） Chicago Sky Blue。使用带有 30 G 针头或更小针头的注射器将溶液填充移液器的后端。或者，对于单细胞近细胞标记，向盐水溶液中加入 2% （w/v） 神经生物素或生物素化葡聚糖胺（BDA-3000 或 BDA-10000）代替 Chicago Sky Blue。
5. 将大鼠放在硬管内的布袜内，放在适当的实验夹具上（图 1）。手术后至少等待 72 小时，然后再将动物放在头枕夹具上。收紧胸骨上部而不是颈部周围的拉绳，以避免阻塞气道。如果呼吸似乎很困难或受阻，请松开拉绳或将其向后移动。在老鼠警觉时执行此程序。
6. 将大鼠上的头部约束板连接到夹具上的相应部件上。为此，首先将头枕板固定到位，然后使用 4-40 螺钉将其固定。一定要等到动物平静下来，以避免对头部施加过大的扭矩。接下来，将 8-32 螺母放在植入大鼠体内的头部约束螺栓上。然后将带螺纹的不锈钢杆拧到头螺栓上。将杆固定在实验夹具上，使其可以拧紧到位（图 1）.
   注意：用头螺栓和头约束板固定动物可最大限度地减少设备的弯曲并提高记录稳定性。在大多数情况下，记录可以在动物被头部约束的第一天开始。但是，如果动物过度坐立不安或发声，请在开始任何录音之前提供一天的头部约束习惯训练。在这种情况下，将动物放在夹具上 15 分钟，然后将其放回笼子中。第二天重复此步骤并继续执行实验步骤。
7. 打开记录室并取出硅凝胶。如果组织在开颅手术中重新生长，请使用细镊子清洁。
8. 将移液器连接到电动显微作器，并插入头部放大器。
   注意：在本演示中，头部平台上的小型继电器电路在放大器引线和高顺应性外部电流源之间切换（图 3A-C）。请注意，某些放大器具有适当的内置高顺从性源。
9. 使用电动显微作器将移液器的尖端移动到记录室中立体定位识别的标记。记下此位置的坐标。小心不要折断头盖骨上的移液器尖端。
10. 将移液器移动到前后轴和内侧轴上所需的记录位置。然后将移液管沿腹侧推进穿过硬脑膜，直到它背侧约 500 μm 到预期的记录位置。
11. 缓慢推进移液器，同时在音频监视器上聆听移液器吸头和参考线之间记录的放大电压的尖峰事件。一旦识别出加标事件，继续将移液器移动 0-100 μm，直到观察到大于约 500 μV 的正向电压偏转。
    注意：发生这种情况时，电极电阻将增加约 1.5-10 倍。
12. 一旦一个单元被隔离，就应该开始记录，以及所有其他感兴趣的行为和生理测量。在本演示中，通过高速摄像监控自生成的振动运动（参见材料部分）。
13. 要标记记录站点，请切换电极引线以连接到电流源。有几种方法可以做到这一点，使用继电器电路（图 3A-C）、放大器上的内置电流源或手动（图 3D）。以 50% 占空比以 2 秒脉冲传递 -4 μA 4 分钟，以通过移液器离子电泳注入 Chicago Sky Blue。
14. 根据标准做法，经过几次标记程序后杀死并灌注动物。根据需要对大脑进行切片和复染，以确定记录部位的解剖位置。对组织进行细胞色素氧化酶反应性复染。或者，使用荧光显微镜鉴定芝加哥天蓝色沉积物。
    注意：为了准确区分不同的标记单位，重要的是所有标签都在同一天使用相同的移液器制作，而无需在标签之间松开移液器。在这种情况下，可以通过它们在事后组织学中的相对位置以及每个位点的记录纵器坐标来区分记录位点。为了明确识别，标记标记彼此之间至少间隔 200 μm，并且每个大脑区域不超过 3-5 个标记。

结果

图 1：实验夹具。用于电生理和行为监测实验的机械夹具中的大鼠图。夹具利用了杆和板

材料