立体定向显微注射病毒载体用于小鼠幼崽纹状体的基因操作

摘要

来源： Chen, S., et al., 新生小鼠脑纹状体细胞遗传学操作的立体定位手术。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了将编码 Cre 重组酶和绿色荧光蛋白（GFP）的病毒载体通过立体定位注射至基因改造小鼠幼崽的纹状体，以切除两侧带有 loxP 位点的 STOP 碟段，实现基因操作，并激活红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 显微注射

1. 使用70%乙醇彻底擦拭立体定位仪，进行无菌手术准备。将手术器械浸入70%乙醇中以灭菌。
2. 用70%乙醇擦洗幼鼠头部。在颅骨上定位人字缝（lambda）标志，并用记号笔标记人字缝。将注射针尖对准人字缝，设定前后（AP）和内外侧（ML）坐标为零。
3. 根据目标位点的X和Y坐标移动注射臂。对于出生后第2天（P2）幼鼠的纹状体，坐标为：AP，人字缝前+2.4 mm；ML，中线左右±1.0 mm；背腹（DV），颅骨表面下−1.7 mm。用笔标记PE10管中快绿染料的位置。
4. 缓慢下放30G注射针，穿透皮肤和颅骨，然后上提针尖，直至其停留在颅骨表面。将DV坐标设为零。
5. 缓慢下放30G注射针，直至到达目标位点的DV坐标。等待1分钟，使脑组织恢复至正常形态，然后启动微量注射程序（100 nL/min）。
6. 确保PE管中快绿染料的标记位置发生移动，以确认病毒液体已注入脑内。
7. 微量注射结束后等待1分钟，然后在30秒内缓慢、逐步将针尖上提至DV深度的一半位置。30秒后，缓慢将针从幼鼠头部完全撤出。

2. 幼崽术后恢复

1. 将幼鼠置于33 °C培养箱中复温20分钟。每5分钟检查幼鼠从低温麻醉中的恢复情况，直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。
2. 待幼鼠完全恢复后，将其送回母鼠身边。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30G PrecisionGlide 针头	Becton Dickinson	REF 305106
Hamilton 微量注射器	Hamilton	80300	适用于PE10管的30G针头；26G针头需要PE20接头
聚乙烯管 PE20	Becton Dickinson	427406
聚乙烯管 PE10	Becton Dickinson	427401
微型流速注射泵	Longer Precision Pump Co.	TJ-2A（控制器）和 L0107-2A（驱动单元）
25G注射器	Becton Dickinson	REF 302105
快绿	Sigma-Aldrich	F-7252	0.10%
标准立体定位仪	RWD生命科学	68037	不使用 68030 小鼠/新生大鼠适配器
LSM 880 共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 880
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40	宾夕法尼亚大学载体中心	AV-9-PV1848	批号 CS0987，5.506×10¹³ (GC/mL)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	杰克逊实验室	7914	Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ	杰克逊实验室	26259	Foxp2fl/fl