全内反射荧光显微镜用于胞吐事件的可视化

摘要

来源：Winkle, C. C., et al．利用联合方法定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生中的作用．J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用全内反射荧光（TIRF）显微镜观察皮层神经元中胞吐事件的方法。一种pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）标记物在囊泡融合时发出荧光，通过选择性的TIRF激发，在时间推移成像中捕捉膜附近区域的胞吐过程。

方案

1. 利用全内反射荧光（TIRF）显微镜成像分泌事件

注意：本方案需要专用的显微镜设备，包括用于维持温度、湿度和二氧化碳（CO₂）的环境培养箱、配备落射荧光照明的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜、高倍率/高数值孔径（NA）的TIRF物镜、自动XYZ载物台以及高灵敏度的电荷耦合器件（CCD）探测器。本方案使用一台完全自动化的倒置显微镜，配备100倍、1.49 NA的TIRF物镜、固态491 nm激光器和电子倍增CCD（EM-CCD）。所有设备均由成像和激光控制软件进行控制。在开始成像方案之前，请先开启环境培养箱、载物台、光源、计算机和相机的电源。

1. 在成像软件中选择物镜。物镜就位后，将物镜加热器固定在物镜环上。
2. 在将培养箱固定到载物台插槽之前，确认物镜已完全降下。将蒸馏水均匀倒入培养箱的注水口，以防溢出。
3. 开启培养系统。打开 CO₂ 气瓶的阀门，并根据制造商说明确认系统压力是否合适。让腔室有一定时间达到 5% CO₂ 和 37 °C。在放入成像培养皿前，先将一个空培养皿放入培养箱，以防止物镜上产生冷凝水。
4. 启动激光光源。
5. 打开培养箱，在物镜上滴加浸油。将样品放入培养箱，并用稳定臂或培养皿配重固定。升高物镜，直至油与样品底部接触。切换至透射光照明，通过目镜找到神经元的焦平面。
6. 启动激光软件并连接至激光控制软件。将照明模式设为宽场，并选择物镜（推荐使用 100x 1.49 NA TIRF 物镜）。设置样品的折射率（细胞约为 1.38）。通过取消勾选 491 nm 激光的“TTL”（晶体管-晶体管逻辑）来调节激光强度：先将滑块调至 100，再降低至 20% 至 40% 之间的某一数值，然后重新勾选“TTL”。
7. 再次使用透射光照明对样品进行对焦。进入成像软件，选择 491 nm 激光照明并打开快门。微调激光在顶壁上的焦点，并在移除聚光镜的情况下，将焦点对准闭场光阑的中心。将聚光镜倒置放置在光学平台上，以防划伤镜头。
8. 重新安装聚光镜，进入 TIRF 软件，将穿透深度（PD）设为 110 nm。然后，将照明模式从宽场切换至 TIRF 模式以进行成像。
9. 使用落射荧光光源和宽场荧光模式，通过目镜寻找表达囊泡相关膜蛋白 2（VAMP2）-phluorin 的细胞。
   1. 调节成像参数（曝光时间、增益和激光功率），在尽可能减少光漂白和光毒性的前提下（例如，曝光时间为 50–100 毫秒，增益为 15–30，最大激光功率的 30%），使用最短曝光时间和最低激光强度，以最大化信噪比和动态范围。
   2. 为每个细胞设置连续自动对焦。以每 0.5 秒采集一次图像的方式，连续采集 5 分钟的时序图像序列。对于净rin-1（netrin-1）刺激条件，在超净台中向细胞培养皿中加入 500 ng/ml 的 netrin-1，随后将培养皿放回培养箱中孵育 1 小时，再开始成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底活细胞成像培养皿	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	必须用 1 mg/mL 多聚赖氨酸-D 涂覆，并在接种细胞前进行冲洗
Olympus IX81-ZDC2 倒置显微镜	Olympus
Lambda LS 氙灯	Sutter Instruments Company
显微镜载物台环境培养箱	Tokai Hit
100 倍 1.49 数值孔径 TIRF 物镜	Olympus
Andor iXon EM-CCD 相机	Andor
Cell TIRF 控制软件	Olympus		用于控制 TIRF 成像激光的软件
Fiji（Image J）	NIH	ImageJ 版本 1.49t
兔多克隆抗人 VAMP2 抗体	Cell signaling	11829
多聚赖氨酸-D	Sigma	p-7886	溶于无菌水，浓度为 1 mg/mL