抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

摘要

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了一种基于微注射的技术，用于在大鼠上丘中同时进行神经元记录和抑制。该操作包括立体定位靶向、颅骨钻孔以及插入一种注射电极（injectrode），该电极在记录神经元活动的同时递送抑制性神经递质。光刺激可诱发动作电位，而药物微注射则抑制神经元兴奋性。随着神经递质水平下降，神经元活动恢复至基线水平，从而能够研究抑制及其恢复过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 记录-注射电极的组装

1. 使用移液器拉制仪拉制一根长约7 cm的玻璃毛细管（外径1 mm）。
2. 打断毛细管尖端，并在光学显微镜下检查其开口，确认内径在30 µm至40 µm之间。
3. 将一根长7 cm的银丝插入玻璃毛细管中，使其从玻璃移液管的非拉细端伸出约1 cm。
4. 将多余的银丝部分垂直弯折至玻璃毛细管轴线方向。
5. 在30 G皮下注射针的针杆上涂抹一滴柔性塑料粘合剂。
6. 按照图1所示示意图，将30 G皮下注射针插入玻璃移液管中。
7. 在玻璃移液管与皮下注射针的连接处再涂一层胶水，以确保密封良好。
8. 将移液管尖端朝上放置约12小时，使其胶水充分固化。最终成品如图2所示。

注意：此操作适用于急性实验，无需对移液器尖端进行灭菌。

2. 动物准备

1. 将大鼠放入麻醉盒中。
2. 使用4%异氟烷诱导麻醉，持续5至10分钟。
3. 将动物置于带有加热垫和直肠探针的立体定位仪上，以维持37 °C的体温。通过鼻罩使用2%异氟烷维持麻醉。使用耳杆和门齿固定器固定大鼠头部。
4. 涂抹眼用软膏或滴眼液，包括1%阿托品滴眼液以帮助瞳孔扩张。为防止眼睛干燥，每隔约30分钟滴一次润滑性滴眼液。
5. 剃除头部毛发，并用10%聚维酮碘溶液清洁。
6. 局部麻醉时，在头皮下2-3个位置提起皮肤，将针尖刺入后，每处注射0.5 ml的2%利多卡因。
7. 通过脚趾夹捏实验确认麻醉程度是否充分，并观察有无肢体活动。此外，监测心率以确保其处于正常范围（300 至 400 次/分钟）。
8. 使用#10手术刀片沿中线直线切开头皮，暴露冠状缝和矢状缝。
9. 用手术 spatula 拨开覆盖颅骨的组织，暴露 Lambda 点和 Bregma 点。
10. 将颅骨调平，使前囟（Bregma）和后囟（Lambda）处于同一平面。
11. 使用立体定位仪，将安装好的玻璃管置于Bregma正上方，以设定参考点。该位置将作为前后方向和内外侧方向测量坐标的“零点”。
12. 通过移动立体定位装置至所需坐标来设定目标位置，记录立体定位坐标，并在目标区域周围绘制一个方框，标记将进行开颅手术的位置。
13. 使用已灭菌的钻头安装在手术钻上，沿着标记的方格缓慢操作，无需施加压力，以逐步去除骨组织。注意避免在同一区域钻孔时间过长，以免产生热量，导致皮质骨发生损伤。
14. 当开颅区域的骨质变得足够薄时，用镊子小心移除颅骨部分以暴露皮层。
15. 用人工脑脊液频繁灌注暴露的皮层，以防止组织干燥。
    注意：由于注射电极的尖端足够坚固，能够穿透，因此在大鼠上无需去除硬脑膜。

3. 注射系统的填充与安装

1. 用矿物油通过抽吸填充5-10 µl微量注射器。
2. 使用固定好的玻璃移液管，向皮下注射针中填充含0.5%芝加哥蓝（Chicago Sky Blue, CSB）和300 µM γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）的溶液，或含2%利多卡因和0.5% CSB的溶液。所有溶液均用生理盐水稀释。
   1. 若待用物质较充足，可使用普通注射器填充，并采用常规预防措施，避免产生气泡。
   2. 若待用物质较为昂贵，可先用矿物油填充注射电极，再通过抽吸方式引入化学试剂。由于矿物油与水之间的密度差异较大，该方法适用于水溶液的注射。
      注意：可加入染料以确认两种液体之间的分界。
3. 为填充注射移液管，先用1 ml注射器通过抽吸吸取溶液，然后缓慢将溶液注入注射移液管中。
4. 仔细检查图1所示区域是否存在泄漏，用棉签清洁这些区域，并通过缓慢继续注射溶液观察是否漏液。
5. 取下1 ml注射器。操作时应保持对活塞施加轻微压力，防止因真空导致溶液从注射移液管中被抽出。
6. 通过抽吸用矿物油填充微注射器，并将其牢固连接至已填充的注射移液管，然后用纱布小心擦去组装好的注射电极表面多余的溶液。
7. 通过注射极小体积的液体（足以在玻璃移液管尖端形成微小液滴）来确认尖端未被堵塞。
8. 将注射电极安装至微泵系统，并确保其固定良好。
9. 将注射电极尖端小心地定位至目标坐标，并将其降低至皮层表面。
10. 使用立体定位装置缓慢将注射电极降至目标结构（本实验中为上丘）的相应解剖坐标位置。
11. 用温热的琼脂覆盖暴露的皮层，以防止组织干燥。

4. 注射与可逆性失活

1. 将微量注射泵设置为以 40 nl/min 的速度注射 400 至 800 nl，并按下运行以开始注射。注意，注射期间放电率会有所下降。
   注意：在实验条件下，神经元活动在 GABA 给药结束后一小时内恢复。可使用任何经过校准的机械装置对微量注射器施加压力以完成注射。
2. 电生理数据采集完成后，采用当地动物伦理委员会批准的方法实施安乐死。

结果

图1：注射电极组件的示意图。 微量注射器（A）连接至记录-注射玻璃微电极，该电极由一个30 G的皮下注射针头（B）粘附在玻璃微电极（D）内的银丝（C）上构成。E

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射泵（UltraMicroPump III）	WPI	#UMP3
注射控制台（Micro4 Controller）	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton 注射器	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	使用容量在 5 至 10 μL 之间的注射器
凝胶型氰基丙烯酸酯粘合剂	Krazy Glue	KG86648R	凝胶形式更易于涂布在 30G 注射针的针杆上
玻璃移液管	WPI	#TW100F-4	薄壁，外径 1 mm，内径 0.75 mm，带细丝的移液管
720 型玻璃微电极拉制仪	Kopf	720
银丝	A-M Systems, Inc.	782500	裸丝，直径 0.010”