小鼠脊髓软膜下基因递送以评估基因表达

摘要

来源：Tadokoro, T.，等。成年小鼠软膜下腺相关病毒9型（AAV9）载体递送。J. Vis. Exp. （2017）

本视频演示了一种在小鼠脊髓中进行软膜下注射以递送基因的技术。该操作包括暴露硬脊膜，穿刺软脊膜，并将携带荧光蛋白表达基因的重组腺相关病毒（rAAV）注入软膜下腔。注射后经过恢复期，病毒可在脊髓细胞中实现基因表达，从而便于研究目的基因的表达情况。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物与手术的一般准备

1. 开始手术操作前，将病毒（AAV9-UBI-GFP [UBI：泛素启动子，GFP：绿色荧光蛋白]；5 µL 分装）解冻。通过将葡聚糖粉末溶于蒸馏水中，配制 5% 葡聚糖（分子量 10,000）溶液。将病毒溶液与 5% 葡聚糖溶液按 1:1 混合，使终浓度为 2.5% 葡聚糖。
   1. 将病毒溶液置于冰上（4 °C）保存。
2. 使用成年 C57BL/6J 小鼠（雄性和雌性，20–30 g）。通过面罩使用 5% 异氟烷（在 O₂ 中，1 L/min）对小鼠进行麻醉，并根据呼吸频率和足垫夹捏反应，在手术期间以 2–3% 吸入异氟烷（在 O₂ 中，1 L/min）维持麻醉。
3. 使用剃毛器剃除动物背部毛发，并用 2% 氯己定清洁皮肤。
4. 在慢性恢复研究中，应遵循严格的无菌操作技术。
5. 若进行腰段软脊膜下注射，使用手术刀切开覆盖于 Th8-L1 椎体区域的皮肤，并用剪刀剥离 Th10–12 脊椎的椎旁肌。
   1. 使用小鼠脊柱夹具将动物固定在标准立体定位仪上。
   2. 使用牙科钻（钻头：0.9 mm，转速：20,000 rpm）磨除 Th10–12 椎体椎板两侧骨质，直至出现裂纹。
   3. 用镊子移除碎裂的骨片，暴露腰段脊髓背侧表面。
   4. 使用 30 G 不锈钢针头和镊子切开硬脊膜约 1 cm。

2. 打开软脑膜并插入软脑膜下针头以递送 AAV9

1. 使用玻璃毛细管夹持器将34G穿透软脑膜针安装到XYZ操纵器的Z臂上（图1A 和 B）。
   注意：制备穿透软脑膜针时，需使用带金刚石研磨板（粗磨，尖端尺寸为5.0 µm至50 µm）的玻璃毛细管斜面研磨仪对34G针的原始斜面尖端进行进一步 sharpening，研磨角度为15–20°。然后将针尖（从尖端起测量长度为1 mm）轻轻弯曲至约90°（图1B，左插图）。
2. 在手术解剖显微镜下（放大倍数设为8–10倍），通过X臂操作，用穿透软脑膜针穿透软脑膜约1 mm（图1C）。
   1. 保持穿透针与组织表面之间的角度为5–10°。
3. 完成软脑膜穿刺后，使用X臂将穿透软脑膜针从软脑膜下腔水平移出（图1D）。
   注意：请记住穿刺部位，并以血管等解剖标志作为参考。
4. 使用连接PE-10或PE-20管路的50 µL微量注射器，将AAV9-UBI-GFP病毒装载至钝头36G注射针中。
5. 使用玻璃毛细管夹持器将注射针安装至第二个XYZ操纵器的Z臂上（图1A 和 B）（图1B，右插图）。
   注意：制备用于软脑膜下AAV9注射的针头时，需使用带金刚石研磨板（粗磨，尖端尺寸为5.0 µm至50 µm）的玻璃毛细管斜面研磨仪对36G针的钝头端进行抛光，以去除锐利边缘。然后将针尖（从尖端起测量长度为2–3 mm）轻轻弯曲至约90°。将穿透软脑膜针和软脑膜下注射针插入长度为1–2 cm的20G不锈钢从动管（距针末端10 mm处），并用环氧树脂胶固定。使用20G（直径0.91 mm）管路可确保与玻璃毛细管夹持器牢固连接。
6. 通过调节第二个操纵器的X、Y和Z臂，将AAV9注射针尖对准先前的软脑膜穿刺部位，然后使用X臂将其经原有软脑膜开口推进至软脑膜下腔约2–3 mm（图1E 和 F）。
   注意：1）AAV9-UBI-GFP的制备按照先前报道的方案进行，最终滴度调整为每毫升1.2 × 10¹³ 基因组拷贝（gc/mL）。2）无需额外标记软脑膜开口位置，因其易于识别（图1D）。
7. 使用50 µL微量注射器将AAV9-UBI-GFP（1.5、3或5 µL）注入软脑膜下腔（实验分组详见 表1）。
8. 完成AAV9-UBI-GFP注射后，将注射针从软脑膜下腔撤出。
9. 使用4.0单股缝线和外科缝合夹关闭肌肉和皮肤。
   注意：无需封闭开放的椎骨。
10. 将动物置于加热垫上使其恢复。
11. 术后每12小时皮下注射一次Buprenorphine（0.05 mg/kg），持续2–3天以控制疼痛。

表1：实验分组。所有实验均在成年C57BL/6J小鼠中进行。

实验组	AAV9 递送部位/水平 (*)	AAV9 注射体积、输注速率	存活时间	组织分析
组 A (n = 7)	C2（双侧）	5 µL/5 分钟	14 天	脑 + 脊髓
组 B (n = 12)	L1-L2（双侧）	1.5 µL 或 3 µL，60 秒/µL	14 天	脑 + 脊髓
组 C (n = 6)	C2 + L1-L2（每个水平双侧）	5 µL/5 分钟	14 天	脊髓
* - 双侧 = 在注射节段的左右软膜下间隙各进行一次软膜下注射，共两次。

结果

图1： 在成年小鼠中进行脊髓软膜下注射的实验装置。（A）为在成年小鼠中实施脊髓软膜下注射，需使用两个独立的XYZ操纵器（I 和 II）。（B）每个操纵器的Z臂均固定一个玻璃毛细管夹持器。其中一个夹持器固定穿透软膜的34...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	Jackson Labs	664
小鼠用标准立体定位仪	Harvard Apparatus	72-9568
小鼠脊柱适配器	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ 操纵器	Stoelting	51604
手动注射泵	Stoelting	51218
34G 斜面 Nanofill 针头	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G 钝头 Nanofill 针头	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso（异氟烷）	MWI Veterinary Supply	502017
氯己定溶液	MWI Veterinary Supply	501027
20G 不锈钢针头	Becton-Dickinson	305175
23G 不锈钢针头	Becton-Dickinson	305145
30G 不锈钢针头	Becton-Dickinson	305128
棉签	MWI Veterinary Supply	27426
玻璃毛细管研磨仪	Narishige International	SM-25B
显微镜载玻片 Superfrost	Leica Microsystems	M80
50 μl 微量注射器	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 管路	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 管路	Becton, Dickinson	427401
4-0 单股缝合线	VetOne	V1D397
玻璃毛细管研磨仪	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 分钟环氧树脂（透明环氧胶）	Devcon	14310
葡聚糖	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD 病毒载体核心实验室