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方法文章

一种新生仔猪缺氧窒息模型

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DOI：

10.3791/3166

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2011年10月11日

 ,  , 
1Departments of Pediatrics, Pharmacology and Surgery, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta

本文内容

摘要

大型动物模型在研究新生儿窒息的生理学和药理学方面具有良好的转化价值。我们采用新生仔猪建立了一种模拟新生儿窒息的实验方案，该模型有利于系统研究全身和局部血流动力学、氧转运及其与生化和病理通路之间的关联。

摘要

每年全球有超过100万新生儿因窒息而死亡。窒息新生儿常出现多器官功能衰竭，包括低血压、灌注不足、缺氧缺血性脑病、肺动脉高压、血管病变性肠炎、肾功能衰竭以及血栓栓塞性并发症。为帮助我们理解新生儿窒息的病理生理学和药理学机制，已开发出多种动物模型。与啮齿类动物和新生羔羊相比，新生仔猪已被证实是一种有价值的模型。新生仔猪具有多种优势，包括其发育程度与人类36-38周胎儿相似，各器官系统可比，体型较大（˜出生时体重1.5-2公斤，可对动物进行仪器监测，并控制缺氧和血流动力学紊乱等混杂因素。

本文介绍了一种模拟新生儿窒息的实验方案，可用于观察窒息及再氧合过程中全身和局部的血流动力学变化，并评估各种干预措施的相应效应。此外，该模型的优势在于可同时研究多器官衰竭或功能障碍及其与不同机体系统之间的相互作用。该实验模型为非存活性操作，涉及对新生仔猪（1-3日龄，体重1.5-2.5 kg，混合品种）进行外科手术置入仪器，以建立机械通气、血管（动脉和中心静脉）通路，并置入导管和血流探头（Transonic公司），从而持续监测不同动脉（包括主肺动脉、颈总动脉、肠系膜上动脉和左肾动脉）内的血管内压力和血流量。在上述手术准备完成后，仔猪需稳定30-60分钟（依据Z<10%的血流动力学参数波动及正常的血气水平确定），随后启动严重低氧血症的实验方案，通过等二氧化碳性肺泡低氧诱导实现。将吸入气体中的氮气浓度提高，使仔猪吸入10-15%的氧气，持续2小时，目标是使动脉血氧饱和度达到30-40%。此种程度的低氧血症可导致临床窒息，表现为严重代谢性酸中毒、全身性低血压以及心源性休克，并造成重要器官灌注不足。低氧阶段之后，先给予100%氧气再氧合0.5小时，随后给予21%氧气维持3.5小时。可在适当时间引入药物干预，并以盲法、区组随机的方式考察其效应。

方案

1. 麻醉

  1. 将麻醉机的流速设定为 2L/min。将废气出口连接至真空吸引装置。
  2. 使用麻醉气体（异氟烷）以 5% 浓度充注面罩（约 3 分钟）。
  3. 新生仔猪通过吸入 5% 异氟烷与 100% 氧气混合气体进行麻醉诱导（约 3 分钟）。
  4. 以 2–3% 异氟烷维持麻醉状态。可根据需要以 0.5% 为单位微调异氟烷浓度，但总体范围可能在 0.5% 至 5% 之间，具体取决于仔猪的状况。
  5. 一旦建立血管通路，可将吸入麻醉转换为静脉麻醉，持续输注芬太尼（5–50 mcg/kg/h）和咪达唑仑（200–500 mcg/kg/h）。在手术期间若需控制过度肌肉活动，可使用泮库溴铵（50–100 mcg/kg/h），同时保留对动物状态的观察能力，以便调整麻醉用药。
  6. 通过脉搏血氧仪监测仔猪（经皮血氧饱和度维持在 95–100%）和心电图（心率维持在 130–170 次/分钟）进行监测。
  7. 使用加热毯和辐射加温装置将仔猪直肠温度维持在 38–40°C。
  8. 在整个实验过程中，定期评估仔猪的麻醉状态，根据需要采用神经学指标（瞳孔大小、流泪、身体运动）、行为学指标（躁动）、心血管指标（心动过速和高血压）及呼吸指标（呼吸急促）进行判断。给予最低限度的肌肉松弛。既往有无使用肌肉松弛剂的仔猪麻醉经验将有助于评估。
  9. 本方案为非存活性操作，实验结束时通过静脉注射过量戊巴比妥（100 mg/kg）实施安乐死。

2. 腹股沟血管导管的外科置入（图1）

  1. 在右侧腹股沟处做一个2-3厘米长的切口。
  2. 分离右侧股静脉和右侧股动脉各1厘米，并在每条血管周围放置两根3-0结扎线。
  3. 右侧股静脉插管：结扎静脉远端。插入Argyle导管（3.5或5 French，双腔）（Covidien, Mansfield, MA）至15厘米深度，使导管尖端位于右心房。用两根结扎线固定导管。该导管可用于维持液体和药物输注（次级端口）以及中心静脉压/右心房压监测（主端口）。
  4. 右侧股动脉插管：结扎动脉远端。提起近端结扎线以阻断血流。插入Argyle导管（3.5或5 French，单腔）至5厘米深度，使动脉导管位于肾下腹主动脉，用于连续平均动脉压监测和采血。用两根结扎线固定导管。
  5. 缝合皮肤。

3. 建立机械通气（图2）

  1. 在颈部做一个2-3厘米长的横向切口。
  2. 分离并暴露1厘米的气管，将两根1-0号线绕气管一周。
  3. 将一根气管插管（3.0或3.5）插入气管1厘米深处，连接呼吸机并开始机械通气，固定气管插管。
  4. 分离并暴露颈总动脉，将血管用超声流量探头（2SB或2RB型，Transonic Systems Inc.，Ithica, NY）环绕，以连续测量血流量。

4. 在肠系膜上动脉（图3）和左肾动脉（图4）放置血流探头

  1. 在皮肤切口前，需追加芬太尼（5-10 mcg/kg）和乙酰丙嗪（0.01-0.02 mg/kg）的剂量。
  2. 作一较长的肋下-腰部切口，并仔细分离肌层。
  3. 暴露腹主动脉。
  4. 尽量减少对血管的操作（避免血管痉挛）和淋巴管损伤。
  5. 游离肠系膜上动脉近端0.5-1 cm，并在其周围放置Transonic血流探头（3SB）。
  6. 游离左侧肾动脉近端0.5-1 cm，并在其周围放置Transonic血流探头（2SB）。
  7. 缝合皮肤并固定血流探头。

5. 肺动脉导管（图5）和血流探头（图6）的放置

  1. 在皮肤切口前，需追加芬太尼（5-10 mcg/kg）和乙酰丙嗪（0.01-0.02 mg/kg）的剂量。
  2. 将动物置于右侧卧位。
  3. 于左侧第4肋间行胸廓切开术。
  4. 注意避免损伤胸内动脉和静脉，必要时予以结扎。
  5. 使用牙科棉签压低左肺，并根据需要增加氧气供给。
  6. 切开心包膜。
  7. 辨认从肺动脉延伸至主动脉的动脉导管。
  8. 可通过在动脉导管起始处放置血管夹或使用粗“3-0 丝线”结扎来闭合动脉导管。
  9. 游离主肺动脉，并使用粗“0号”丝线穿过血管套带。
  10. 在肺动脉根部行荷包缝合（5-0聚丙烯线），用于放置肺动脉导管。
  11. 将带有3个侧孔（距导管尖端至少1 cm）的20G套管针经荷包缝合处插入，插入深度最多1 cm。
  12. 检查静脉血是否通畅流出。
  13. 连接压力传感器，检测肺动脉压力及波形。
  14. 收紧荷包缝合线并固定肺动脉导管。
  15. 将Transonic血流探头（6SB）放置于主肺动脉周围。
  16. 在血流探头与动脉之间涂抹超声耦合凝胶，以确保最佳信号传导。
  17. 用浸有生理盐水的纱布覆盖创面。

6. 缺氧与复氧实验方案

  1. 通过增加吸入氮气浓度，将吸入氧浓度降低至10%，以诱导低氧血症。
  2. 将吸入氧浓度调节在10%至15%之间，使PaO2维持在20–40 mmHg或SaO2维持在30–40%，持续2小时。
  3. 进行动脉血气分析以评估PaCO2，并相应调整呼吸机通气频率。
  4. 在诱导低氧血症后，第一个小时用于稳定诱导心动过速（及心输出量）反应。
  5. 持续监测颈总动脉、肠系膜上动脉和左肾动脉的血流变化。
  6. 在低氧的第二小时，增加低氧应激强度，使心输出量稳定下降至基础值的30–40%，平均动脉压降至30–35 mmHg，动脉pH值降至6.95–7.05。
  7. 根据实际情况，可提前终止或延长低氧应激15分钟。
  8. 通过停止氮气吸入，立即将吸入氧浓度迅速提高至100%，并继续给予纯氧。
  9. 监测心输出量、平均动脉压及其他血流动力学参数，观察其快速恢复情况。
  10. 以100%氧气进行复苏可继续0.5小时。在此时间段结束后，迅速将吸入氧浓度降至21%。
  11. 在实验剩余时间内继续以21%氧气进行再氧合。如有需要，可将吸入氧浓度滴定至25%。
  12. 在实验期间，根据需要可酌情给予乳酸林格液10 ml/kg的液体冲击治疗。其使用必须按照既定方案进行。

7. 代表性结果：

在新生仔猪缺氧的最初一小时内，缺氧血症的诱导应使心输出量（肺动脉血流）增加至基础值的120%–130%（图7A），心率也相应升高（图7B）。通常，心输出量在缺氧开始后的前0.5至1小时内达到代偿峰值。此外，血流应出现中枢化，表现为肠系膜和肾血流灌注减少，而颈总动脉血流保持不变或增加（图8）。在第二小时缺氧期间，心输出量持续下降，出现低血压（图9A），心率减慢，可伴有或不伴有心律失常。缺氧应引起肺动脉高压，表现为肺动脉压力升高（图9B），但在缺氧末期30分钟内，随着心输出量下降，肺动脉压力有时可能降低。

复苏后，除肾血流在复氧最初1小时内逐渐恢复外，所有血流动力学参数均会立即恢复至常氧基线水平。然而，在复氧最初2小时内，血流动力学参数特别是心输出量和平均动脉压将逐渐恶化，分别降至常氧基线水平的70-75%和35-45 mmHg。这种心血管功能障碍至少部分归因于心肌顿抑，需要采用血管活性药物和正性肌力药物等心血管支持治疗。

显示在动物组织中植入导线的手术过程，用于生物医学研究。
图 1： 腹股沟切口及股动脉和股静脉导管的放置

外科手术、兽医手术、特写、医疗器械、组织、切口、探针插入
图 2： 颈部切口，显示气管插管的放置以及颈总动脉周围血流探针的安置

外科手术、人体组织操作、使用镊子、解剖结构可视化、精细解剖。
图3： 腹部侧切口及肠系膜上动脉的分离

使用钳子和探针进行组织手术，突出解剖探索装置。
图 4： 腹侧切口并分离左侧肾动脉

展示插入导管的器官暴露手术过程，体现生物医学设备的使用。
图 5： 肺动脉导管置入术的开胸操作

显示气管插管和气道管理设备用于呼吸分析的手术示意图。
图 6：胸廓切开术及在主肺动脉周围放置 Transonic 流量探头

心输出量和心率图；缺氧-再复氧对缺氧组与假手术组的影响
图7： 缺氧和再复氧期间（A）心输出量（肺动脉血流）和（B）心率的时间变化

动脉血流图；缺氧-复氧效应对颈动脉、肠系膜动脉、肾动脉的研究
图 8： 缺氧与复氧期间，(A) 颈总动脉、(B) 肠系膜上动脉和 (C) 左肾动脉血流量的时程变化

缺氧-复氧压力图；全身、肺动脉压力随时间变化；数据分析。
图9： 缺氧和复氧期间（A）平均动脉压和（B）肺动脉压的时间变化

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讨论

当前实验方案的优势在于能够检测新生个体在缺氧及再氧合过程中全身性和区域性血流动力学的变化。我们还可以评估用于改善恢复期心血管功能的各种干预措施的各自效应。我们及其他研究者已报道了关于新生儿窒息研究中的经验与发现，涉及心血管功能的影响1肺部2神经学3，胃肠道4，肝的5，肾脏6，肾上腺7 和血液学8 系统。尽管理解心血管功能需要基于连续数据测量的信息，但在技术上对小型动物（如啮齿类动物或豚鼠）进行手术操作以实施监测具有挑战性，甚至可能无法实现。然而，超声成像和实时成像等技术的最新进展或许能够克服其中部分难题。尽管如此，使用大型动物还可在实验期间同步采集生物样本，包括血浆和组织样本。此类额外的生物样本采集将有助于开展生化检测和组织学检查，从而增进对缺氧与再氧合过程中的病理生理学及药理学机制的理解。虽然本研究的主要目标是 体内 动物模型可能用于研究单一身体系统的病理生理功能，但重要的是要在器官间相互作用的背景下加以理解。例如，在新生儿窒息导致的多器官功能...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢加拿大卫生研究院（MOP53116）和阿尔伯塔医学研究遗产基金会分别提供的运营资助和启动基金，以支持本实验模型的开发。

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参考文献

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