小鼠脊髓窗植入术用于活体成像

摘要

来源：Pietruczyk, E. A., 等．小鼠椎板切除术与脊髓窗植入．J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了在麻醉小鼠体内植入脊髓窗以进行活体成像的操作。该方案通过使用硼硅酸盐盖玻片和3D打印的背板来稳定暴露的脊髓组织。此方法可实现高分辨率的双光子显微成像，用于研究血脑屏障动态变化及神经血管相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 盖玻片植入

1. 轻轻将一块3 mm的硼硅酸盐盖玻片覆盖在暴露的脊髓上。
2. 确保琼脂糖已冷却至39 °C。使用小刮刀将温热的2%琼脂糖/aCSF（人工脑脊液）涂抹于盖玻片边缘，利用毛细作用使其流入盖玻片下方。
   注意：当温度低于39 °C时，琼脂糖可能开始凝胶化。若发生此情况，可使用水浴或微波炉重新加热。部分操作者倾向于先滴加一滴琼脂糖，再将盖玻片覆盖其上。
3. 在完整相邻椎体的暴露骨性关节突上涂抹组织粘合剂，具体位置为第11胸椎棘突和第13胸椎棘突处。在椎板切除区域周围、邻近肌腱及横突上，再以环形方式涂抹额外的组织粘合剂。
   注意：组织粘合剂对于后续步骤中与牙科水泥的牢固结合至关重要。关节突形成一个天然的支撑面，可使背板稳定放置（图1）。与关节突的粘附将构成植入物最牢固的固定点。
4. 在瓷质调拌盘中将牙科水泥与加速剂混合。使用小刮刀将牙科水泥转移至组织粘合剂层上。利用牙科水泥将背板粘附于手术区域，中心对准观察窗。静置10分钟，使牙科水泥固化。
   注意：背板与前、后关节突的牢固粘附，为植入物提供了基本的结构稳定性。
5. 使用额外的牙科水泥填充背板内部基底以及背板与组织界面的下方区域。
   注意：额外涂抹牙科水泥可增强粘附性，并降低显微镜物镜浸没液（生理盐水）从背板底部渗漏的风险。
6. 将叉形背板固定夹推进至观察窗上方的适当位置。用螺钉将背板固定于背板固定夹中。
   注意：本方案使用了定制加工的背板固定夹（图2G‒H）。
7. 向背板上滴加生理盐水以检测是否渗漏。若发现液体渗出，应擦干区域并补充涂抹牙科水泥。

2. 成像准备

1. 将动物转移到光学平台上的手术台。
   注意： 我们的手术平台、背板固定器和异氟烷鼻罩固定器可作为一个整体单元，在持续给予异氟烷麻醉的条件下，于手术站与双光子成像站之间转运图 2D, H）。类似的装置可由商用的持针叉、横梁和支撑柱组装而成（例如（ThorLabs公司）。进行活体显微成像时，显微镜物镜与光学平台之间应至少保留11英寸的空间，以容纳手术平台的高度。
2. 使用不锈钢安装柱和沉头夹紧叉将手术平台固定在光学平台上。
3. 将新鲜的生理盐水加入背板的孔中。将水浸物镜浸入孔内的液体中。
4. 使用透射光或落射荧光观察以确定目标区域并调焦。切换至激光扫描模式并进行 体内 根据组织中存在的荧光染料，选择适当的双光子激光激发波长、二向色镜和带通滤光片进行成像6。

结果

图1. 脊髓窗解剖位置的示意图。A) 下胸椎椎体、棘突和脊髓（sc）节段的俯视示意图。虚线圆圈表示关节突的所在位置，即背板粘附的主要支撑点。B) 脊髓窗俯视示意图。目标椎骨（此处为T12）已被移除。一层薄的琼脂糖覆盖在脊髓表面。盖玻片置于琼脂糖之上。组...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印椭圆形背板	定制		稳定成像视野
手术解剖显微镜	Leica	M205 C	配备 Leica FusionOptics、Planapo 0.63x M 系列物镜和滑动载物台
显微镜相机	Leica	MC170	用于可视化手术视野的高清彩色相机
滑动载物台	Leica	10446301	滑动载物台由两块金属板构成。底板固定，上层板在润滑界面上滑动，以实现旋转和线性移动
手术台及稳定叉	Whale Manufactoring	定制	椎板切除术
SomnoSuite 低流量异氟烷输送系统	Kent Scientific	SS-01	配备集成数字蒸发器的手术麻醉给药装置
不锈钢 1.5 英寸安装柱	ThorLabs	P50/M	用于将手术台安装到光学平台上，以进行双光子成像
1.5 英寸安装柱用沉头夹紧叉	ThorLabs	PF175	用于将手术台固定在光学平台上，以进行双光子成像
理想骨微型钻	Harvard Apparatus	72-6065	用于椎板切除术中磨薄骨组织
水浴锅	Fisher Scientific	15-462-10	加热生理盐水
电凝枪	FST	18010-00	处理轻微出血
加热垫	Benchmark	BF11222	1.9” x 4.5” 硅胶加热器，带 20” 铁氟龙导线，10W，5V
K 型热电偶直肠探头	Physitemp	RET3	测量小鼠体温
凡士林	Sigma	8009-03-08	润滑直肠探头
反馈调节式温控器	定制	NA	市售替代品包括 Physitemp TCAT 系列
PVA 外科眼用棉签	Beaver-Visitec International	40400-8	吸收血液
电动剃毛器	Wahl	41590-0438	修剪小鼠毛发
刀片，#11	FST	14002-14	手术工具
镊子，#5	FST	11254-20	手术工具
镊子，#4	FST	14002-14	手术工具
钛制齿状镊	WPI	555047FT	手术工具
钛制虹膜剪	WPI	555562S	手术工具
Vetbond 组织粘合剂	3M	084-1469SB	为牙科丙烯酸树脂处理组织表面
陶瓷混合托盘	Jack Richeson	420716	混合牙科丙烯酸树脂与加速剂
Orthojet 牙科丙烯酸树脂	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	将背板永久粘合至组织
小圆形盖玻片，#1 厚度，3 mm	Harvard Apparatus	64-0720	光学窗口
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	用于 aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	用于 aCSF
葡萄糖	Fisher Scientific	50-99-7	用于 aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	用于 aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	用于 aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	用于 aCSF
卡洛芬	Rimadyl	QM01AE91	镇痛
抑菌水	Henry Schein	2587428	卡洛芬的稀释剂
异氟烷	Henry Schein	11695-6776-2	麻醉
乳酸林格溶液	Baxter	0338-0117-04	小鼠补液
高 EEO 琼脂糖	Sigma	A9793	凝胶点 34–37 摄氏度
眼科润滑软膏	Akwa Tears	68788-0697	防止角膜干燥
MOM 双光子显微镜	Sutter