静脉注射受体阻滞剂以减轻小鼠模型中的脑水肿

摘要

来源：Zeynalov, E. et. al., 持续静脉输注是研究小鼠中风诱发脑水肿时使用精氨酸加压素受体阻滞剂考尼伐坦的首选给药途径。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在小鼠模型中通过静脉注射给予精氨酸加压素（AVP）受体拮抗剂的方法。通过短暂性大脑中动脉闭塞诱导脑水肿，经左侧颈静脉导管给予AVP受体拮抗剂，可减轻水肿。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体内脑卒中诱导

1. 手术前用牙科树脂预涂覆尼龙丝。
   1. 从7-0尼龙缝合线剪取一段12 mm长的尼龙丝。将2份树脂与1份硬化剂混合，立即把尼龙丝末端浸入混合液中，使其约1/3长度被覆盖。迅速取出，并确认其表面均匀覆盖一层光滑的牙科树脂涂层。
   2. 将尼龙丝在空气中干燥2小时后使用。
2. 将小鼠放入麻醉诱导室（2 L容积），设置气流为2 L/min，其中含1.5%异氟烷和25%富氧空气，通入诱导室。
3. 让小鼠留在诱导室内，直至完全麻醉，判断标准为对尾部夹捏无反应。
4. 将小鼠置于带有加热垫的手术台上，将异氟烷浓度调至1%，通过鼻罩自主吸入以维持麻醉状态。
5. 剪除颈部前后方的毛发，并用异丙醇喷洒颈部消毒。在双眼涂抹兽用眼膏。
6. 术中使用连接至数字显示器的直肠温度探头持续监测体温。
7. 将小鼠置于仰卧位，使用10%聚维酮碘擦洗液进行消毒，覆盖无菌手术巾，然后用10号手术刀片沿颈部正中线做切口。
8. 用6-0丝线暂时结扎左侧颈总动脉（CCA）。
9. 在左侧颈外动脉（ECA）上再结扎一道。
10. 在颈内动脉（ICA）上放置一个微血管夹。
11. 用微血管剪在颈外动脉上剪开一个小孔。将由7-0尼龙缝合线涂覆牙科树脂制成的线栓从ECA开口插入，并向头端推进，同时移除微血管夹，直至遇到阻力（距CCA分叉点约5-7 mm）。
12. 在颈内动脉上打一个临时结，以固定线栓位置。参见示意图Figure 1A。用丝线缝合皮肤，并在颈部前方伤口处浸润0.2 ml的0.5%布比卡因，操作同第2.6步。
13. 让小鼠在恢复室中苏醒并恢复意识60分钟。在小鼠尚未恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。
14. 对小鼠进行神经功能缺损评分（NDS）测试，标准如下：0 = 运动功能正常；1 = 提尾时躯干和对侧前肢屈曲；2 = 静息时运动正常，但向对侧转圈；3 = 静息时向对侧倾斜；4 = 无自发运动活动。
    1. 进行NDS测试时，提起小鼠尾巴，将其置于平坦表面观察2-3分钟。也可在恢复室中观察小鼠行为。若小鼠NDS低于2分，表明大脑中动脉（MCA）闭塞不充分，应排除出实验。​
       注意：可采用激光多普勒血流仪技术确认MCA是否成功闭塞。
15. 在恢复60分钟后，按上述方法再次将动物放入诱导室进行再麻醉，用10%聚维酮碘擦洗液重新消毒原皮肤切口，并剪开移除丝线，重新打开颈部前方手术切口。
16. 为从ECA取出线栓，请执行以下步骤：
    1. 在ICA上放置一个微血管夹。松开ICA上的结扎线，在保持夹子开放的同时将线栓抽出。
    2. 关闭微血管夹，并在切口近端的ECA上打结。
    3. 移除CCA上的夹子和结扎线，以恢复脑部血流。参见示意图Figure 1B。

2. 颈静脉置入静脉（IV）导管以进行持续48小时治疗

注意：在完成步骤 1.16.3 后，立即进行导管植入操作，期间不得唤醒小鼠。

1. 使用两种不同尺寸的软管：将内层软管（外径 0.94 mm，用于输送输注药物）插入外层软管（外径 3.18 mm，用于保护内层软管）。
2. 将小鼠置于俯卧位，使用10%聚维酮碘擦洗液进行消毒，用10号手术刀片在颈部背部做1 cm切口。将小鼠转为仰卧位，用10%聚维酮碘擦洗液再次消毒颈部前面，并重新打开颈部前面的手术切口。将导管从背部切口经皮下隧道穿至颈部前面，并从开放伤口处向外引出1 cm。
3. 从颈部前方中线外侧约1 cm处去除左侧皮下脂肪组织。定位左侧颈静脉，在静脉上放置两条相距5 mm的结扎线，并轻轻拉伸静脉。用显微血管剪在两条结扎线之间的颈静脉上剪一小孔，将内层导管尖端向尾侧（朝向心脏方向）插入5 mm深。
4. 用两条结扎线将导管固定于颈静脉。使用3-0丝线缝合颈部前方的皮肤。请参考图示， 图1C.
5. 用缝线将导管固定在小鼠颈部背面的皮肤上，并通过旋转连接器将导管连接至微输注静脉泵。旋转连接器可使小鼠在笼内自由活动，同时能够自由获取食物和饮水。
6. 在颈部前侧和后侧的皮肤切口处分别注入 0.2 ml 的 0.5% 布比卡因，以预防术后疼痛。
   注意： 根据各机构特定的动物实验方案，动物可在术前和术后接受阿片类药物、非甾体抗炎药（NSAIDs）或抗生素治疗。然而，上述治疗可能影响缺血性脑卒中结局的实验结果。
7. 让动物在恢复室中苏醒，随后将其单独饲养在笼具中直至实验终点。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧姿势之前，不得使其无人看护。
8. 设定康尼伐坦（0.14 mg/ml 溶于5%葡萄糖）或载体溶液的输注速率，按1.5 ml/kg/hr进行持续48小时静脉输注，并开始输注。
   注意： 静脉输注的考尼伐坦总剂量应约为 0.2 mg/小鼠/天，总体积为 1.44 ml。

结果

图1：实验性脑卒中模型、静脉导管安装示意图及脑卒中后48小时的代表性梗死体积。 在闭塞期间（A）和再灌注期间（B），涂有树脂（绿色）的蓝线所示尼龙线在左侧颈内动脉（ICA）中的位置。左侧颈静脉中软管尖端的正确位置（C）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	K&H Manufacturing Inc	1060
带直肠探头的温度监测仪	Physitemp	7029
6-0 丝线缝合线轴	Surgical Specialties Corporation	SP114
带针3-0 丝线缝合线	Ethicon	1684G
7-0 尼龙缝合线	Ethicon	1696G
含硬化剂的牙科树脂聚硅氧烷	Heraeus Kulzer	65817930
微输液静脉泵	Kent Scietific	GT0897
22号旋转接头	Instech	375/22PS
实验室导管，0.94 × 0.51 mm	Dow Corning	508-002
实验室导管，3.18 × 1.98 mm	Dow Corning	508-009