小鼠模型中胶质细胞重编程的立体定位病毒载体注射

摘要

来源：Pereira, M. et. al., 通过脑内注射病毒载体在体内直接重编程常驻胶质细胞为中间神经元。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了将腺相关病毒通过立体定位注射到转基因小鼠的大脑皮层中，以将Cre依赖的神经元重编程基因和荧光报告基因递送至胶质细胞。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 将重编程因子注射到脑内

1. 动物准备、立体定位放置与钻孔注意事项：本方案重点介绍使用 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1（ALN）将 NG2（神经元-胶质抗原 2）胶质细胞重编程为中间神经元的方法。根据我们的经验，使用其他因子组合也可获得表型相似的中间神经元。
   1. 将立体定位仪的 M/L-D/V 臂移动到位（位于动物上方），并固定好。
      注意事项：立体定位仪可沿前/后（A/P，Y 轴）、内侧/外侧（M/L，X 轴）和背/腹（D/V，Z 轴）方向调节注射器位置。
   2. 移动注射器，使其玻璃毛细管尖端刚好位于前囟（bregma，即颅骨板交汇处）上方。
   3. 确保毛细管尖端在 A/P 和 M/L 两个平面上均完全水平。若前囟位置不明确，可取外侧缝与中线缝的平均值作为参考。
   4. 当毛细管尖端准确置于前囟上方时，在数字坐标计数器上将 M/L 和 A/P 坐标值均重置为 0.0。
   5. 为确保动物头部处于完全水平位置，使用数字坐标计数器测量 A/P 臂位于 +2.0 和 -2.0（M/L = 0.0）时，以及 M/L 臂位于 +2.0 和 -2.0（A/P = 0.0）时的 D/V 坐标值，并相应调整门齿杆和耳杆的高度。
   6. 将注射器移至纹状体内病毒载体注射所需坐标位置（相对于前囟：A/P = +1.0；M/L = -2.0）。
   7. 略微抬高注射器，通过显微镜观察注射部位，使用牙科钻在注射坐标处钻孔，以环形轻柔方式开始钻孔。
      注意事项：不要施加过大的向下压力，钻头应足够锋利，无需额外用力即可穿透骨质。避免长时间连续钻孔，以免产生热量。
   8. 钻孔结束后，检查硬脑膜是否保持完整并暴露，以便进行注射。
2. 注射器准备
   1. 用一块棉纱布覆盖开放切口，并用生理盐水冲洗注射器。
   2. 冲洗后，吸取 1–2 μL 空气泡，随后吸取 1 μL 含病毒载体的溶液，避免产生非预期气泡。确保在注射过程中，病毒溶液位于气泡下方，易于观察。
3. 病毒注射
   1. 移除覆盖切口的棉纱布，利用立体定位仪的 D/V 臂降低注射器。接近颅骨表面时，通过显微镜仔细观察，并测量硬脑膜的 D/V 坐标值——其应在轻微压力下略有隆起。
   2. 当毛细管尖端接触硬脑膜时，将 D/V 坐标设为 0.0。
   3. 继续缓慢降低注射器至目标深度（相对于硬脑膜：D/V = -2.7）。确保进针路径无骨碎片阻碍，避免针头/毛细管发生弯曲。
      注意事项：上述坐标适用于在 NG2-Cre 小鼠纹状体内注射重编程因子。也可根据需要使用对应其他脑区的坐标。在对新小鼠品系进行重编程因子注射前，应先使用染料（如台盼蓝）、有色微珠或携带报告基因的病毒载体测试注射坐标。若使用台盼蓝，动物需在术后立即处死并取出脑组织。新鲜脑组织可在冷冻状态下用切片机切片，通过观察染料在脑内的位置确定注射位点。若使用有色微珠，则可在注射一周后，通过灌注固定并切片的脑组织确定注射位置。此外，也可注射携带报告基因的病毒载体，并在灌注固定后切片脑组织以确定注射位点。
   4. 以 0.4 μL/min 的速率注射 1 μL 病毒溶液。注射完成后，留置 2 分钟以允许溶液扩散，再撤出注射器。
   5. 扩散期结束后，缓慢回撤注射器，直至毛细管尖端完全退出脑组织。
   6. 用一块棉纱布覆盖伤口，并用生理盐水冲洗注射器。
   7. 将立体定位仪的 M/L-D/V 臂移出操作区域。
4. 伤口缝合与术后处理
   1. 使用缝合线小心缝合切口。
      注意事项：所有用于注射动物的缝合线应丢弃于含有抗病毒洗涤剂溶液的杯子或小瓶中。该溶液也用于清洁所有与手术材料接触过的手术区域表面。所有手术器械应在每日手术结束后彻底清洗并高压灭菌。
   2. 将动物从立体定位仪上取下，放入术后恢复站，其中包括清洁的加热笼具、食物和饮水供应，动物需在此停留直至完全清醒。在此期间应密切监测动物，直至其意识恢复。
   3. 在手术动物完全恢复前，不得将其与未手术动物同笼饲养。
   4. 每日监督手术动物状况。根据所用缝线类型，必要时应及时拆除。所有动物均在术后皮下注射布托啡诺（Temgesic，剂量为 1 ml/kg）。
      注意事项：若连续两天使用同一注射器，应在每次使用后依次用水、70% 乙醇和水冲洗，并在夜间注满水以溶解可能残留的物质。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物模型
NG2-Cre 小鼠	Jackson	NG2-CrexB6129, Stock #008533
试剂
水
生理盐水	Apoteket AB		70%
乙醇	Solveco
异氟烷	Apoteket AB		用温水稀释至1%溶液
卫可（Virkon）	Viroderm	7511
戊巴比妥钠	Apoteket AB	P0500000	腹腔注射，终末操作剂量为60 mg/ml
蔗糖	Merck	S0389-500G
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	15250061
逆行荧光微球（Retrobeads）	Lumafluor	R170
布托啡诺	Apoteket AB
设备			From RSG Solingen
剪刀	VWR	233-1552	From Biochem
镊子	VWR	232-0007
持针钳	VWR	232-0120
手术刀柄	VWR	RSGA106.621	20号
手术刀片	VWR	RSGA106.200
立体定位仪	Stoelting Europe	51500D
小鼠耳杆	Stoelting Europe	51648	5 µl
带可拆卸针头的注射器	Hamilton Company	65	内径0.75，外径1.5。
玻璃毛细管	Stoelting	50811
玻璃毛细管拉制仪	Sutter company	P-1000
牙科钻	Agnthos AB	1464
剃毛器	Agnthos AB	GT420
异氟烷麻醉舱及泵	Agnthos AB	8323101	2 mL
注射器	Merck	Z118400-30EA	25G
针头	Merck	Z192414 Aldrich
用于立体定位仪的小鼠和新生大鼠适配器	Stoelting	51625
加热垫	Braintree scientific, inc	53800M
棉纱布	Fisher Scientific	22-037-902
橡胶管	Elfa Distrelec	HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150
棉签	Fisher Scientific	18-366-473