电泳递送GABA至麻醉小鼠的癫痫灶

摘要

来源：Slezia, A. et al. 电泳递送γ-氨基丁酸（GABA）至癫痫灶可预防小鼠癫痫发作。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了通过电泳方式递送γ-氨基丁酸（GABA），以抑制麻醉小鼠的癫痫样发作活动。视频概述了探针植入、神经活动记录、癫痫诱导，以及通过微流控离子泵精确递送GABA以评估其治疗效果的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 手术/开颅术

1. 将麻醉小鼠的头部固定在立体定位仪上。使用30 G针头，在计划切口部位皮下注射局部镇痛药罗哌卡因（5 µL，7.5 mg/mL，参见材料表），注射后静置5分钟使其起效。
2. 用手术刀在颅骨上方的皮肤正中做一直线切口。用精细镊子轻轻将皮肤向两侧牵拉，并用鳄鱼夹（bulldog serrefine clamps）固定于两侧，暴露颅骨以进行后续操作。
3. 使用手术刀或其他类似工具清除颅骨表面的筋膜组织。若出现表层出血，可用棉签或小块纸巾吸除血液。
4. 取一根涂覆有聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）的接地螺钉（规格：#00，直径：0.047 英寸，长度：1/8 英寸，参见材料表），其上已焊接导线，将导线通过连接器与放大器前置放大头级相连。
5. 在预定钻孔位置润湿颅骨，使用直径为0.4 mm的细圆钻头在小脑上方高速钻孔，直至暴露硬脑膜。将接地螺钉插入孔中，并用精密螺丝刀旋入，直至其顶端到达小脑表面。
   注意：该头颅螺钉经含1%（质量分数）3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷（GOPS）的PEDOT:PSS溶液浸涂处理，随后在140 °C下烘烤90分钟。PEDOT:PSS是一种具有体积电容特性的共轭聚合物，已知具有良好的生物相容性。GOPS作为交联剂与PEDOT:PSS混合，可增强其在水性环境中的稳定性（图1）。
6. 借助立体定位仪，测量目标脑区的立体定位坐标。例如，若目标区域为海马体，则根据小鼠脑图谱，其前后向（AP）坐标为Bregma点后方-1.8 mm，内外侧向（ML）坐标为Bregma点右侧1.8 mm。
   注意：上述坐标对应右半球（图1）。
7. 使用可靠的牙科钻机（参见材料表），在目标脑区上方的颅骨区域以高速打磨出直径约1至2 mm的范围，直至形成一层薄而光滑透明的骨膜。
8. 随后，若骨膜足够薄（<200 µm），可用细镊子刺破并轻柔地移除该薄层骨组织。使用自制钩状针头去除硬脑膜。应尽量缩小颅骨开窗（craniotomy）和硬脑膜切开（durotomy）的尺寸，以防止脑水肿形成，并减少心脏和/或呼吸引起的脑组织搏动。
   注意：颅骨开窗区域必须用一滴生理盐水填充，以防干燥，并在实验过程中定期补充（图1）。

2. 多通道硅探针的插入

1. 将硅探针以轻微的前后（AP）角度（20°）固定在立体定位臂上，以便为另外两个植入物的放置留出充足空间，并使电极、离子泵和微移液管的记录位点与注射位点尽可能接近。
   注意：电极、注射器和离子泵均用一滴DiI染料溶液（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐 [DiI]）覆盖，用于术后可视化观察植入路径（DiI浓度为0.5 mg/ml，溶剂为二甲基亚砜）。
2. 将硅探针安装在连接磁性支架的立体定位臂上，并将其置于立体定位架旁。设定前后角度（20°），然后将探针连接至前置放大器和接地螺钉。
3. 借助微米级精度的立体定位臂或电动显微操作器，缓慢将硅探针插入海马体，避免产生横向移动（图1和图2）。
   1. 启动记录软件，通过前置放大器、连接的放大器和计算机，在将多通道硅探针从皮层顶部逐步推进至目标背腹（DV）位置（距皮层表面-1,800 µm）的过程中，持续记录神经元电活动信号。在计算机屏幕上实时记录并观察局部场电位信号（LFP）。
      注意：控制探针下降速度，使其在记录过程中缓慢且连续地下降，以便更清晰地监控穿刺过程并准确到达目标区域。
   2. 利用多通道硅（Si）探针记录的LFP中，海马结构锥体层出现的尖波（ripple）活动作为目标区域的标志。
      注意：尖波活动可见于多通道硅（Si）探针上一个或两个相邻记录通道，这些通道之间的记录位点间距为100 µm（图3）。
   3. 通过多通道放大器软件（见材料表），利用多通道硅（Si）探针同步记录皮层和海马各层的LFP信号（图3）。

3. 微流控离子泵（µFIP）的插入

1. 将管路（参见材料表）连接至µFIP的入口，并用0.05 M γ-氨基丁酸（GABA）溶液填充探针。移除管路，并用石蜡膜包裹密封入口。将电极引线连接至源测量单元。
2. 借助立体定位臂，以正中-侧向（MP）角度（20°）插入µFIP。硅探针在整个过程中保持插入状态。
   注意：µFIP非常柔软，可在到达脑表面之前借助干净细小的画笔提供支撑以保持其笔直。完成此步骤后，可通过轴向移动轻柔地下降µFIP。
3. 通过轴向移动缓慢下降µFIP，在到达背腹向（DV）坐标（皮层表面下-1,200 µm）之前，切勿使其在行进路径中发生弯曲。
   注意：考虑到µFIP尖端出口处300 μm的距离，应尽量使两个装置（µFIP和硅探针）彼此靠近。
   警告：插入过程中避免各装置及其连接部件之间发生任何机械干扰（图1B和图2B）。

4. 癫痫发作诱导装置的准备

1. 更换注射器（10 µL）的金属针头（参见材料表）。取下针头固定用的金属部件，安装并固定玻璃微电极（外径 [OD]：1.2 mm，内径 [ID]：0.75 mm，尖端直径：20–50 µm，柄部锥形部分长度约 ± 0.5 cm），然后重新装回针头固定部件。
2. 将注射器及其连接的硼硅酸盐玻璃微电极以20°的外侧向内侧（LM）角度定位，用于注射4-氨基吡啶（4AP）（50 mM，溶于人工脑脊液 [ACSF] 中）。
   注意：切勿使用注射器的金属针头，或尖端直径大于50 µm的玻璃微电极。
3. 借助自动微量注射泵吸取500 nL–1 µL的50 mM 4AP溶液。

5. 插入连接注射器的玻璃移液管以注射4AP

1. 将连接至注射器的玻璃微电极移至目标 DV 位置（-1,500 µm），然后注入 250 nL 的 4AP 溶液（图 1 和 图 2）。启动记录软件开始记录，观察屏幕并等待首次痫样放电（interictal spike）出现。
2. 一旦首次痫样放电出现，立即通过 µFIP 开始递送 GABA。在源极与靶点之间施加 1 V 电压，持续 100 秒，随后关闭 1 秒，重复 30 个循环。借助记录软件，至少持续记录 2 小时。
   注意：递送的 GABA 总量约为 1 nmol（图 4）。
3. 实验结束后，轻柔取出插入的探针和接地螺钉，将动物从立体定位仪上移下。通过腹腔注射过量麻醉药物（100 mg/kg 戊巴比妥钠）实施安乐死。通过呼吸和循环停止确认动物死亡。

结果

图1：小鼠脑部的颅骨钻孔术及植入物定位。（A）手术操作、颅骨钻孔以及小鼠脑内植入物靶向位置的示意图。（B）三种装置植入时所用的立体定位坐标及角度。µFIP = 20° 内外侧（ML），-1,200 µm DV（绿色）；多通道硅探针 = 20° 前后向（AP），-1,80...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4AP	Sigma	275875
放大器	Neuralynx, 蒙大拿州, 美国	Digital Lynx 4SX
放大器	Ampliplex	KJE-1001
立体定位图谱	Allen Atlas	978-0470054086
硼硅酸玻璃移液管	Sutter	BF120-69-15
脑组织固定架	WPI	RBMA-200C
骨剪	FST	16109-14
连接器	INSTECH	SC20/15
棉签	Monoprix	EMD 6107OD
盖玻片	Menzel-Glass	15747592
DiI 染料	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
钻机	FOREDOM	K1070
镊子	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GOPS	Sigma	440167-100M
哈密尔顿注射器	Hamilton	80330
颅骨螺钉	Component Supply	TX00-2FH
加热垫	Harvard apparatus	341446
注射泵	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
氯胺酮	Renaudin	5787419
磁力固定架	Narishige	GJ-1
小鼠	Charles River	612
机械操纵器	Scientifica, 英国	IVM
磷酸氢二钠	Sigma	255793
磷酸二氢钠	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
纸巾	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
直肠温度探头	Harvard apparatus	521591
罗哌卡因	KABI	1260216
生理盐水	Sigma	7982
手术刀	F.S.T	AUST R195806
注射器	BD Medical	324826
动脉夹	F.S.T	18050-28	建议使用4个
硅探针	NeuroNexus, 密歇根州, 美国	A2x16-10mm-50-500-177 或 A1x16-5mm-150-703
立体定位仪	Stoelting	51733U
赛拉嗪	Bayer	4007221032311