慢病毒表达载体是稳定表达各种效应分子或报告基因构建体的最有效工具，适用于分裂和非分裂的哺乳动物细胞以及完整生物体。本文提供了一种将慢病毒表达构建体包装成假病毒颗粒，并利用这些假病毒颗粒转导靶细胞的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
与标准质粒载体类似，可以将慢病毒载体以质粒形式转染入细胞，实现效应分子的瞬时表达，但转染效率较低至中等。然而，将慢病毒表达载体包装成假病毒颗粒后，即使对于难以转染的细胞（如原代细胞、干细胞和分化细胞），也能实现高达100%的转导效率。此外，慢病毒递送不会引发化学转染通常伴随的特异性细胞反应，例如转染试剂毒性导致的细胞死亡1, 2。当假病毒颗粒转导靶细胞后，慢病毒载体可整合至基因组DNA中，从而实现对短发夹RNA（shRNA）、cDNA、microRNA或报告基因的稳定表达3, 4。含有嘌呤霉素抗性或GFP等筛选标记的表达载体可用来分离稳定表达效应分子的靶细胞。假病毒颗粒感染靶细胞后无法在其中复制，因为病毒的结构基因已被删除，且长末端重复序列（LTRs）在转导后会自我失活5, 6。
高效的慢病毒包装需要三个主要组分1, 5, 6, 7。
1. 慢病毒表达载体，包含包装所需的某些遗传元件，可实现病毒表达结构在基因组DNA中的稳定整合以及效应分子或报告分子的表达。
2. 慢病毒包装质粒，提供将表达结构的RNA拷贝转录并包装成重组假病毒颗粒所必需的蛋白质。本方案使用pPACK质粒（SBI），其编码来自HIV或FIV基因组的gag、pol和rev蛋白，以及水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）作为病毒包膜蛋白。
3. 293TN生产细胞（源自HEK293细胞），表达SV40大T抗原，这对于高滴度慢病毒的产生至关重要，同时还含有新霉素抗性基因，可用于细胞的重新筛选和维持。
病毒制备流程的概览见图1。病毒制备始于将慢病毒表达载体和包装质粒共转染至293TN生产细胞。病毒颗粒被分泌到培养基中。转染后48–72小时收集细胞培养上清。去除上清中的细胞碎片后，使用PEG-it沉淀法通过离心浓缩病毒颗粒。所获得的慢病毒颗粒可进行滴度测定，并用于转导靶细胞。本方案未包含病毒滴度测定的具体细节，相关内容可参见：
http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8。
本方案已使用指定的特定产品进行优化。其他试剂可替换使用，但无法保证获得相同的结果。
方案
1. 使用包装质粒和表达载体转染293TN细胞
- 种子 7.0 - 8.0 x 106 每15 cm的293TN细胞2 在含有 DMEM 培养基、4 mM L-谷氨酰胺、4.5 g/L 葡萄糖和 10% 胎牛血清（不含抗生素）的 20 ml 培养液中培养培养板。于 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养 18–24 小时 37 °C 含5% CO2 使细胞密度在转染时达到60-80%融合度。在某些情况下，可能需要接种多块细胞培养板，以获得足够高的滴度用于靶细胞的转导。
- 对于每孔细胞，向已灭菌的 2 ml Eppendorf 管中加入 1.6 ml 无血清 DMEM。加入 45 μl pPACKH1 或 pPACKF1 和 4.5 μg 将慢病毒载体构建体加入DMEM中，并通过上下吹打混匀。
- 添加 55 μl 将PureFection加入同一管中。涡旋振荡10秒。将DMEM-质粒-PureFection混合物在室温下孵育15分钟。
- 将 DMEM-质粒-PureFection 混合物逐滴加入组织培养板中，轻轻摇晃以均匀分散至整个培养板。将培养皿放回培养箱中继续培养，于 37 °C 含5% CO₂2.
- 无需在转染后更换培养基。如果您的慢病毒载体构建体表达了编码荧光蛋白（如GFP）的基因，请在转染后12–24小时在显微镜下观察细胞。您应能够看到 >90% 的细胞呈绿色荧光蛋白阳性，表明转染成功。
- 在培养48小时和72小时后，收集细胞培养上清液至50 ml无菌离心管中。此时细胞培养上清液中含有具有感染性的假病毒颗粒。（操作时应遵循生物安全二级（BSL-2）级别的推荐安全规范。）在室温下以1,500 × g离心15分钟，以沉淀细胞碎片。将病毒上清液转移至新的离心管中，注意勿扰动沉淀。
- 用于病毒包装的293TN细胞应弃置于生物危害容器中，不得用于后续的病毒包装实验。
2. 病毒上清液的浓缩
- 向每4体积含有慢病毒颗粒的上清液中加入1体积的冷（4 °C）PEG-it病毒沉淀溶液。从大体积溶液中沉淀慢病毒颗粒时，可使用Corning 250 ml聚丙烯离心管。通过反复倒置管子混合溶液，但切勿涡旋震荡混合物。
- 将溶液在4 °C冰箱中静置至少12小时（最长可至4天）。冷藏过程中切勿摇动或旋转离心管。
- 在4 °C条件下以1,500 × g离心30分钟，对上清液与PEG-it混合物进行离心。离心后，慢病毒颗粒将以浅黄色或白色沉淀物的形式出现在管底。倾去上清液。
- 用移液方式彻底去除残留液体，注意不要扰动沉淀中的慢病毒颗粒。残留的微量PEG-it会稀释病毒（从而降低滴度），但由于PEG-it为惰性且无毒性，不会影响靶细胞的完整性。
- 使用冷（4 °C）无菌磷酸盐缓冲液或含25 mM HEPES缓冲液的DMEM，将慢病毒颗粒重悬并合并为原始体积的1/100。
- 分装至无菌冻存管中，于-70 °C保存，直至使用。
3. 病毒滴度测定与靶细胞转导
- 建议在转导目标细胞之前，先对慢病毒颗粒进行滴定，并计算目标细胞的适当感染复数（MOI），以确保实验间的一致性。对于病毒滴定，推荐使用 HT1080 细胞作为易于感染的阳性对照细胞系。请注意，滴定方案涉及使用您所制备的慢病毒颗粒的小份样品转导 HT1080 细胞。一旦确定滴度，即可用所产生的慢病毒颗粒转导目标细胞。推荐的滴定方案请参见：http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7。
- 在 24 孔板中，每孔接种 50,000 个目标细胞，加入细胞培养基，使用细胞常规培养所用的培养基。在指定的培养条件下培养过夜。转导当天，细胞融合度应介于 50% 至 70% 之间。
- 转导当天，吸除细胞培养基。将培养基与 TransDux 混合，使 TransDux 的终浓度为 1×（例如，500 μl 培养基中加入 2.5 μl TransDux）。然后将 TransDux-培养基混合液加入各孔中。
- 用移液器向每孔加入对应于目标细胞最佳 MOI 的适量病毒。若最佳 MOI 未知，建议尝试一系列不同的 MOI 值（例如，对于易感染的组织培养细胞，可尝试 MOI 为 1、2 和 5；对于较难感染的原代细胞，可尝试 MOI 为 1、10 和 20）。若慢病毒颗粒浓度未知（未通过病毒滴定方案测定），可尝试不同体积的病毒，例如 1、2 和 5 μl。病毒可与目标细胞共孵育长达 72 小时。
- 转导后 72 小时，待病毒载体整合至宿主细胞基因组后，即可开始对转导后的目标细胞进行后续实验。根据细胞的具体需求更换培养基并传代目标细胞。
4. 代表性结果
293TN 细胞的转染
293TN 细胞的起始密度对于成功进行病毒包装至关重要。转染当天，293TN 细胞的融合度必须达到 60–80%。图2）。如果 293TN 细胞融合度低于 60%，则需继续培养数小时后再进行转染。如果 293TN 细胞 >当细胞融合度达到80%时，应在转染前重新接种。
如果使用表达GFP的慢病毒载体，转染后24小时，至少应有90%的293TN细胞呈现绿色荧光，表明转染成功（图3）。若GFP阳性细胞少于90%，则不应进行下一步操作，因为这表明转染未成功，病毒滴度将会很低。此时，应重新接种新的293TN细胞并重新开始实验，确保转染前293TN细胞处于适当的细胞密度。
转染后48-72小时，293TN细胞可能会从组织培养板上脱落。这不会对慢病毒颗粒的产生产生负面影响。
使用 HT1080 细胞进行滴定
可根据制造商的说明，使用 SBI 的 Global UltraRapid Titering 试剂盒计算病毒滴度。该系统利用 qPCR 检测慢病毒载体中的 WPRE 序列在 HT1080 细胞中的整合情况，并将其与基于基因组参考序列的标准曲线进行比较，从而准确测定每毫升的感染单位（图 4）。
靶细胞的转导
若使用表达组成型活性 GFP 标记的慢病毒颗粒，在转导反应有效的情况下，GFP 阳性细胞应在转导后 12–24 小时内开始出现。当慢病毒载体稳定整合至宿主细胞基因组后，GFP 表达应持续存在。若使用不同的感染复数（MOI）进行转导，GFP 荧光强度应大致与 MOI 相对应，即低 MOI 时 GFP 荧光较弱，而高 MOI 时 GFP 荧光增强（图 5）。
图1. 病毒制备流程概览。将慢病毒载体与pPACK包装质粒混合后共转染至293TN细胞中。转染后48–72小时，收集病毒上清，并使用PEG-it沉淀病毒颗粒。经滴度测定后，慢病毒颗粒可用于转导目的靶细胞。点击此处查看高清大图。
图 2. 293TN 细胞的相差显微图像。转染当天，细胞密度应维持在 60–80% 汇合度之间。
图3. 转染Purefection、pPACKH1及编码GFP的慢病毒载体构建体后24小时，GFP阳性293TN细胞的荧光图像。
图4. 使用SBI的Global UltraRapid Titering试剂盒测定WPRE的qPCR结果及标准曲线，用于计算MOI以及包装病毒颗粒的相应滴度。
图 5. HT1080 细胞经不同剂量慢病毒感染后的荧光图像。图像采集于转导后 72 小时。
讨论
该病毒包装及靶细胞转导实验方案已针对SBI的病毒包装试剂进行优化。使用其他试剂可能影响本实验方案的结果。本方案仅针对慢病毒的生产进行了优化，可能不适用于其他类型病毒或假病毒的制备。
成功的病毒包装依赖于多个关键步骤。293TN细胞表达SV40大T抗原，这对于慢病毒颗粒分泌至细胞培养上清液中至关重要。转染时293TN细胞的密度尤为关键，以确保PureFection试剂能够充分将慢病毒载体和包装质粒转入细胞内。将PureFection混合物逐滴加入组织培养板后，充分轻柔摇晃培养板，有助于包装质粒和慢病毒载体构建体在所有细胞中的均匀分布。若载体分布不均，可能导致产生的慢病毒颗粒数量不足。病毒包装反应可根据组织培养板的表面积进行放大，以制备高滴度病毒。可根据需要包装的每种构建体，选择接种多块组织培养板的293TN细胞。浓缩病毒上清液对于获得高滴度病毒尤为有利。可将来自多块培养板的细胞病毒上清液合并后进行浓缩，用于后续实验。 体内 实验，或对于难以转导的细胞。
对产生的慢病毒颗粒进行滴定，对于计算用于靶细胞转导的准确感染复数（MOI）至关重要。了解特定转导实验中所使用的MOI，有助于在转导失败时进行问题排查。例如，若使用的MOI过低，可能导致仅有极少数靶细胞表达目标载体；然而，若MOI过高，则可能导致靶细胞出现应激迹象。理想目标是选择一个MOI，既能最大化目标载体的表达，又能维持细胞的健康状态。尽管我们推荐采用基于qPCR的滴定方法，通过检测HT1080细胞中慢病毒载体的整合拷贝数来测定滴度，但也可使用其他滴定方法，例如p24 ELISA或估算GFP阳性细胞百分比。
靶细胞的成功转导还依赖于多个关键因素。TransDux 是一种独特的感染辅助试剂，能够实现高效的转导效果，同时对细胞无毒性。TransDux 可替代常对靶细胞有毒性的多聚素（polybrene）。在靶细胞转导过程中加入 TransDux 有助于中和病毒颗粒表面的电荷，促进病毒进入细胞。由于 TransDux 对细胞无毒，因此可使慢病毒颗粒与细胞持续接触长达 72 小时（此时病毒载体已整合至宿主细胞基因组），从而提高病毒颗粒进入细胞的概率。对于某些难以转导的细胞，可在连续数天内重复进行转导以提高转导效率。例如，在第 1 天进行转导，第 2 天让细胞休息，然后在第 3 天再次进行转导。需要注意的是，在最后一次转导后，必须等待 72 小时，方可开始对靶细胞进行筛选、进一步实验或表征分析。
高效的病毒包装还依赖于慢病毒载体中5'和3'LTR区域之间的片段大小。该片段应约为9 kb或更小，相当于天然HIV基因组的大小。若超过9 kb，所产生的假病毒颗粒滴度可能会降低。新型技术（如piggyBac转座子载体）可通过单次转染实现长达100 kb的外源基因可靠且稳定的整合。对于超出慢病毒载体容量限制的构建体，在能够转染靶细胞的情况下，可采用该方法，且额外优势在于无需进行病毒包装步骤9,10。
采用本方案产生的假病毒颗粒具有感染性，能够感染大多数哺乳动物细胞类型。然而，本方案所用试剂属于第三代生物安全级别，可产生非复制型且自我失活的假病毒。因此，一旦转导至靶细胞或动物体内，这些靶细胞或动物本身不会具有感染性或传染性。尽管在技术上可替换为非第三代生物安全级别的慢病毒载体质粒，但从生物安全角度并不推荐这样做。病毒生产流程以及后续对靶细胞的转导操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南11，在生物安全二级（Biosafety Level 2）条件下进行，研究人员在操作病毒颗粒时应始终穿戴实验服和手套。使用过的293TN生产细胞、病毒颗粒管以及一次性移液器应弃置于适当的生物危害容器中。可重复使用的移液器和玻璃器皿须经漂白剂处理并高压灭菌，以降低人员暴露风险。
披露
本视频文章的制作和免费访问由 System Biosciences 赞助。
致谢
我们谨向SBI的工作人员和科学家表示感谢，感谢他们在这些实验方案的开发与测试过程中提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 高糖培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 11995-073 | |
| 293TN 细胞 | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | 用于基于 HIV 的慢病毒载体 |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | 用于基于 FIV 的慢病毒载体 |
| 任意慢病毒载体 | SBI | Various | cDNA、shRNA、microRNA、转录报告基因 |
| Purefection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 | |
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 | |
| Global UltraRapid Titering 试剂盒 | SBI | LV961A-1 | 本方案中未描述，但用于测定病毒颗粒滴度 |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
参考文献
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