小鼠脑内靶向神经元基因编辑的立体定位病毒注射

摘要

来源：Fricano-Kugler, C. J., et al. 通过立体定位注射设计、包装和递送高滴度 CRISPR 逆转录病毒和慢病毒。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了立体定位病毒注射技术，用于在小鼠大脑中实现精确的神经元基因编辑。该方案可确保将病毒准确递送至齿状回，从而实现荧光标记和CRISPR介导的基因敲除，以在活体条件下研究神经回路、基因功能及疾病机制。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 立体定位注射

1. 确认手术室通风已打开，以确保适当的气流。使用含4%异氟烷的诱导室对小鼠进行麻醉，以准备手术。麻醉后，剃除头部毛发以准备注射部位。
   1. 使用镊子将小鼠舌头向下并向一侧移动，将其固定于立体定位仪中。将咬合杆插入小鼠口腔，直至牙齿落入凹槽，然后固定耳杆。确保小鼠身体位于加热垫上，鼻部处于鼻罩内，并向鼻罩中通入4%异氟烷。通过用镊子夹捏小鼠足部并确认无惊跳反射来验证麻醉效果。
   2. 涂抹人工泪液以润滑眼睛。使用聚维酮碘和利多卡因交替擦拭剃毛后的头部，完成注射部位的准备。
2. 使用手术刀沿头皮正中线做一小切口。如有必要，用棉签蘸取过氧化氢干燥颅骨，以帮助识别前囟。
   1. 在解剖显微镜下定位颅骨上的前囟，并将钻头尖端置于前囟处。在x、y和z三个平面上将数字立体定位坐标归零（或记录）。
   2. 为确保头部在前后（y轴）方向上水平，将钻头置于后囟位置，并调整头部使前囟与后囟处的z坐标大致相等。
   3. 为确保头部在x轴方向上水平，将钻头置于y = 1/2后囟位置。确保矢状缝两侧（x = ±1 mm）的z坐标均为1 mm。若在后囟左右各1 mm处z坐标存在差异，则调整颅骨位置。
3. 将钻头移至目标坐标位置。对于齿状回，使用从前囟起y = -1.9、x = ±1.1的坐标。钻孔前，将异氟烷浓度降至2%，然后缓慢而小心地钻穿颅骨。
   1. 完成所有钻孔后，将装有液体的注射器固定到立体定位仪上。目视将注射器对准钻孔中心，并在颅骨表面将z坐标归零。
   2. 缓慢将注射器降至最深的z深度。对于齿状回，z深度分别为-2.5、-2.4和-2.3。使用立体定位注射仪以0.25 µl/min的速率开始注射。
      1. 在最深z深度完成注射后，等待1分钟，然后提升至下一个坐标并再次开始注射。重复此模式，直至所有z深度坐标均完成注射。最后一次注射完成后，等待2分钟再移除注射器。
         注意：在小鼠脑半球内注射病毒量达2 µl时，尚未观察到对组织产生不良影响。
   3. 对其他钻孔重复上述注射操作。
4. 注射完成后，将小鼠从立体定位仪中取出，使用6-0丝线缝合头皮切口，并在伤口处涂抹利多卡因和抗菌软膏。
   1. 通过腹腔（I.P.）注射0.8–1.0 ml生理盐水+酮洛芬（3–5 mg/kg）以缓解疼痛。随后将小鼠放入加热的恢复室中。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得离开无人看管；在完全恢复前，不得将其放回与其他动物共同饲养的环境中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位手术试剂
兽用注射器 T.B. 注射器，仅限1cc鲁尔滑动式，每盒100支	Med-Vet International	1CCVLS
异氟烷
不锈钢手术刀片，#10，每包100片	Med-Vet International	JOR580S
人工泪软膏	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
聚维酮碘消毒液	Med-Vet International	HPIV108208H
生理盐水	Med-Vet International	DYND500MLSH
棉签	Med-Vet International	CTA6
三重抗生素软膏	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® 针头软包装 25G × 5/8英寸	Med-Vet International	25058
6-0 丝线缝合线	Med-Vet International	MV-711