采用跨物种比较方法研究父性行为的神经生物学机制

摘要

比较物种方法使行为神经科学家能够探索与特定行为相关的各种神经生物学因素，这些行为被视为特定动物模型的特征。该技术利用近缘物种之间自然存在的行为差异，无需采用侵入性手段即可调控行为的表达。

摘要

行为神经科学的一个目标是确定调节特定行为的潜在神经生物学因素。为了实现这一目标，研究人员常使用动物模型，并采用多种方法学策略，其中许多需要侵入性技术来调控目标行为的强度（例如，损毁法、药理学操控、微透析技术、基因工程动物模型）。采用比较物种的研究方法，可使研究人员充分利用近缘物种间自然存在的应答策略差异。在我们的实验室中，我们使用两种在父性反应上存在差异的Peromyscus属物种。雄性加州鹿鼠（Peromyscus californicus）表现出与雌性相同的亲代照护行为，而其近亲普通鹿鼠（Peromyscus maniculatus）在幼崽存在时几乎不表现出任何养育或亲代行为。本文特别关注的是，对雄性加州鹿鼠所表现出的亲社会行为相关的神经生物学因素进行探讨。由于行为神经科学研究方法具有多维度特点，本文将简要介绍研究中的以下几个关键环节：适用于此类研究的物种选择；用于行为分析的数据采集；脑组织的制备与切片；用于精氨酸加压素免疫反应定量分析的免疫细胞化学基本步骤；利用神经影像软件对脑组织进行定量分析；采用微序列视频分析对行为进行评分；以及最终采用适当的统计分析方法，以对研究结果做出最为准确的解读。

方案

1. 动物模型的鉴定

1. 加州鹿鼠（Peromyscus californicus）是研究父性反应的理想模型。如您所见，这种雄鼠会像母鼠一样舔舐幼崽——它们甚至会弓起身体伏在幼崽上方，看起来就像幼崽正在哺乳。加州鹿鼠的行为可与同属的另一种物种——普通鹿鼠（Peromyscus maniculatus）进行对比，后者对幼崽几乎不感兴趣，常常试图逃离甚至攻击幼崽。（参见图1，了解这两种物种与幼崽互动的照片。）
2. 确定物种模型后，需要建立不同的实验组。本研究中使用了两种物种的生物学父亲（亲生父亲）、无育儿经验的处鼠（virgin）以及有限接触过幼崽的处鼠（即“接触过幼崽”或“寄养父亲”），以便评估先天倾向性和后天获得性的父性特征。在本项研究中，我们还让所有实验组接触一只玩具鼠幼崽，以确保观察到的社会互动行为是针对幼崽的特异性反应，而非对笼内任何物体的普遍反应（参见图2）。
3. 在探究神经生物学因素之前，重要的是要确认所选物种在目标行为上表现出明显差异。在本研究中，将雄性个体与一只幼崽共同放入笼中持续五分钟，并采用父性行为记录表（行为谱，ethogram）对行为进行评分，例如接近幼崽的潜伏期以及与幼崽接触的时间长短（行为谱示例见表1）。若观察到攻击性行为，则立即移除幼崽。这些实验过程通常会被录像，以便后续进行细致的行为分析。

2. 准备脑组织

1. 按照每只小鼠的标准灌注流程（附操作方案），取出大脑，以便在特定感兴趣区域进行切片（展示大脑）。
2. 使用标准小鼠脑图谱（展示图谱）定位下丘脑中的室旁核，该区域已知富含本研究关注的神经肽——精氨酸加压素（AVP）的产生细胞。
3. 随后将大脑进行修块并固定于冷冻夹持器上，使组织在切片前先行冷冻。先以修片模式用切片机对脑组织进行切片，直至识别出特定解剖标志，然后设定用于分析的脑切片厚度（本实验为30 µm）。
4. 将脑切片小心转移至盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的多孔板中；（PBS配制方案见附件；请注意，此仅为标准免疫细胞化学实验方案的一个示例）。

3. 免疫细胞化学

1. 在整个实验过程中（参见附带的实验方案），准确的移液操作技能至关重要，以确保对该技术所需的各种化学试剂及其他成分进行精确量取（向学生演示移液操作）。
2. 该过程的第一步是清洗脑组织，需在孔板中用PBS洗涤三至五次；每次更换PBS后，将孔板置于摇床上振荡10分钟（向学生演示更换PBS及将孔板放置于摇床的操作）。
3. 随后将脑切片置于一抗溶液中，并在4 °C条件下于摇床上孵育过夜（演示该过程）。
4. 再次洗涤后，脑切片在室温下于摇床上与二抗溶液孵育1小时，之后再进行一次洗涤。
5. 接下来，脑切片将接触亲和素-生物素复合物（Avidin-Biotin Complex）溶液，以准备显色标记神经化学物质阳性细胞。
6. 在最终显色步骤中，脑切片将接触DAB溶液。DAB为危险化学品，操作时必须始终谨慎。如图所示，脑切片在显微镜下会迅速变暗（演示该过程）。
7. DAB显色完成后，脑切片需经历最后一轮系列洗涤，随后小心地转移至涂胶载玻片上，室温下静置过夜使其自然干燥（演示将脑切片放置于载玻片上的操作；参见附带的涂胶载玻片制备方案）。
8. 随后，载玻片需经过一系列蒸馏水和酒精洗涤进行透明处理，最后浸入Citrosolv中，再加盖盖玻片，并存放在载玻片盒中妥善保存（演示该过程的各个步骤；参见附带的透明处理方案）。

4. 神经定量分析

1. 切片干燥后，可使用专业的神经定量分析软件进行评估。此处使用 Bioquant 软件对小鼠脑内室旁核中加压素阳性细胞和纤维进行定量分析（在屏幕上展示软件及显微镜）。
2. 通过软件的测量功能确定目标区域，以建立用于神经定量分析的视野范围。重要的是，每只动物的定量视野大小应保持一致（展示学生操作过程）。
3. 此处可见深染的加压素免疫反应阳性细胞体和纤维。由于该组织难以手动计数或追踪，该软件的特殊功能可通过光密度阈值设定，来确定目标区域内阳性染色组织的总量。该阈值设定可告诉我们目标区域中有多少部分含有加压素阳性组织（在计算机屏幕上展示数据值）。

5. 行为学分析

1. 如果有多名观察者将对录像进行评分，则必须建立评分者间信度，以确保各观察者对行为的评分方式具有一致性。在实际评分过程中，应准备行为评分表，以便在观察期间方便地记录行为（参见表2中的评分表格示例）。
2. 对于非快速发作性反应的行为，可采用微序列分析，以揭示特定反应进展过程中的细微特征。例如，理毛行为由一系列极快速的反应组成。虽然一种选择是仅记录理毛行为的发生与否及其持续时间，另一种方法则是详细记录伴随该行为的一系列事件。使用此类微序列分析软件时，观察者将根据软件提示，每秒判断特定行为是否出现（展示软件与视频）。
3. 数据采集完成后，需确定感兴趣的参数，并对相应的行为评分进行分析。例如，可分析与幼崽接触的总持续时间，或理毛序列中中断次数（展示已输入每只动物数据的电子表格计算机界面）。
4. 行为评分完成后，需确认本研究中两种物种在目标行为上表现出不同的反应策略。在此案例中，加州鹿鼠应表现出比普通鹿鼠更强的父性行为。此外，可将多种行为指标与脑部测量指标进行相关性分析，以更全面地理解相关影响因素。

6. 代表性结果：

1. 为了验证该模型，数据应明确表明两种物种在目标行为上表现不同。此处可见，P. californicus 雄性个体花更多时间进行理毛和伏身于幼崽上方的行为，这是父性反应的两个典型特征（见图4）。
2. 为了确定所关注的神经生物学变量在父性反应中的重要性，对多个相关脑区的加压素（AVP）阳性组织量进行了定量分析；如图所示，具有父性的 P. californicus 动物在多个脑区中表现出更多的免疫阳性组织（见图5）。
3. 在一项相关的研究中，采用微测序分析方法，假设具有父性的加州小鼠比未交配个体表现出更低的焦虑水平；相应地，在暴露于捕食者气味时，父鼠在理毛序列中的中断次数少于未交配动物（见图6）。

图 1：（A）雄性加州小鼠对同种异亲幼崽表现出父性反应。（B）雄性鹿鼠在同种异亲幼崽存在时表现出谨慎接近（伸展探查）和回避反应。注意：在这些社会互动评估中，若雄性对幼崽表现出攻击性反应，实验人员会立即轻敲笼子顶部以分散其注意力。此时试验即终止，幼崽被取出，检查是否有伤口，并送回母鼠身边。在我们实验室中，P. californicus 雄性极少出现此类攻击行为，但 P. maniculatus 雄性偶尔会出现；然而，密切观察和及时干预可防止动物受到伤害。

图 2： 一只加州小鼠与玩具小鼠互动；大多数个体试图啃咬这些刺激物。

图3： 研究的实验设计；每个物种每组约有6只动物。

图 4： 免疫细胞化学过程示意图。

图 5. 加州小鼠与鹿鼠的父性行为反应；在加州小鼠中观察到更多的父性行为反应（理毛、下蹲、更快接近）。在鹿鼠中观察到更多的伸展探查行为（应激反应）。

图6. 两种小鼠不同脑区中的加压素免疫反应性。加州小鼠在PVN细胞及其纤维中显示出更强的染色。

图 7： 在存在捕食者气味的情况下，具有父代经验的加州小鼠（P. californicus）在其理毛序列中的中断次数少于有幼崽接触经验组和未交配组。

讨论

本文讨论了行为神经科学研究成功实施所必需的三个关键要素：（1）具有代表性和有效性的动物模型；（2）准确且灵敏的免疫细胞化学实验方案；（3）对行为学和脑组织数据进行充分的分析（包括观察性分析和统计学分析）。在任一环节出现错误，都极有可能影响整个研究的结果。因此，在谨慎选择合适的动物模型后，应投入大量精力对行为学和组织学实验程序进行预试验，以确保研究中能够可靠地观察到目标行为，并顺利完成脑组织的后续处理。

如前所述，利用比较物种来确定特定反应的神经生物学机制是一种有价值的方法学途径，因为该技术不需要基因工程或造成疼痛的外科操作。因此，这种方法使用了受威胁程度较低的完整动物。然而，即使动物饲养在实验室环境中，通过引入类似自然的环境，仍可增强对动物自然变异的研究力度。此外，如果能够将实验室研究扩展到野外，以进一步验证物种间在目标行为上的差异真实性，则建议采取这一步骤。尽管比较方法具有诸多优势，但其局限性在于数据的相关性；因此，应结合其他技术（如药理学操控）进一步验证目标神经生物学系统在目标行为中的作用。

当实验人员对行为学、组织学和统计学操作流程已有充分把握后，应确保除实验干预外，所有实验组动物的饲养条件保持一致。实验室中的光照周期、噪音水平、饲养人员、湿度以及气味等变量的改变，均可能对动物的神经生物学反应产生显著影响。

本文中使用了用于检测加压素的主要抗体，但也可使用其他主要抗体来检测多种不同的神经化学物质。如果实验者使用一种新抗体，进行滴定实验以确定该抗体的最佳稀释度非常重要。很多时候，所使用的抗体浓度过高（如供应商建议的浓度），会导致组织着色过深而无法区分信号；此外，过量使用抗体也会造成很高的成本。

最后，如果可以使用多种统计分析方法来提供对数据的不同视角和解释，则应加以利用。在本项研究中，采用了广义线性模型、相关性分析以及多维尺度分析，以提供对数据最具信息量的解读。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双目复式显微镜	Motic	BA400
BIOQUANT 生命科学软件	BioQuant 图像分析公司	版本 8.40.20
冷冻切片机	Microm International	HM525
Masterflex 控制台驱动 Easy-Load L/S（灌流泵）	Cole-Parmer	7518-00
24 孔细胞培养板（组织培养处理；无热原聚苯乙烯；无菌）	Corning	3526
25×75×1 mm 显微镜载玻片	Globe Scientific, Inc.	1324W
22×50 mm No.1 盖玻片	Globe Scientific, Inc.	1414-10
非无菌 3 mL 带刻度大球泡移液管	Electron Microscopy Sciences	70962-9	&nbps;
Alconox 洗涤剂粉末	Alconox, Inc.	1104
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888-1kg	CAS 7647-14-5
磷酸二氢钠	Spectrum	SO130	CAS 10049-21-5
磷酸氢二钠二水合物	Sigma-Aldrich	30412	CAS 10028-24-7
Triton X	Spectrum	TR135	CAS 9002-93-1
Permount	Fisher Scientific	SP15-500	CAS 108-88-3
硫酸铬钾	Sigma-Aldrich	C-5926	CAS 7788-99-0
CitriSolv	Fisher Scientific	22-143975
乙醇，高纯度聚乙烯瓶装，200 证明，24×1 品脱	Pharmco-AAPER	111000200CSPP
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000
兔抗加压素特异性分析试剂	Immunostar, Inc.	20069
生物素化抗兔 IgG（H+L）亲和纯化抗体	Vector Laboratories	BA-1000
Elite 标准 Vectastain ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100
DAB 过氧化物酶底物试剂盒	Vector Laboratories	SK-4100
原味明胶（4 包装小袋）1 盎司盒装	Knox		在当地杂货店购买
3% 过氧化氢	CareOne		在当地药店购买
漂白剂	Clorox		在当地杂货店购买