基于渗透泵的神经治疗药物递送在脱髓鞘小鼠模型中的应用

摘要

来源：Wang, X. et. al.，基于渗透泵的药物递送用于中枢神经系统体内再髓鞘化研究。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在脱髓鞘小鼠模型中使用渗透泵递送神经治疗药物的方法。通过控制药物释放，激活胼胝体中的髓鞘生成细胞，从而促进髓鞘再生。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 建立溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘小鼠模型

1. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配制1%溶血卵磷脂（也称为L-α-溶血磷脂酰胆碱）溶液。
2. 通过高压灭菌法对剪刀、镊子、弯止血钳及其他手术器械进行灭菌。对手术区域进行消毒，并铺上无菌巾。手术所用的所有材料和试剂均应以无菌方式准备。在整个操作过程中，保持手术区域的无菌状态至关重要。
3. 对出生后第56天（P56）的C57BL6小鼠进行麻醉，步骤如下。
   1. 将小鼠放入小动物麻醉机的异氟烷麻醉舱中。调节氧气（O₂）流速为300–500 mL/min，异氟烷浓度为3%–4%。待麻醉充分，小鼠静止不动且呼吸缓慢稳定后，将其转移至带有加热垫的立体定位仪上。
   2. 将气体输出从麻醉舱切换至麻醉面罩，并将异氟烷浓度调节至1%–1.5%以维持麻醉状态。待小鼠完全麻醉后，经腹腔注射酮洛芬（3–5 mg/kg）以缓解疼痛。手术前轻捏小鼠脚趾，观察其反应，以确认麻醉成功。
   3. 麻醉状态下，小鼠无法自主调节体温，因此需在手术期间持续监测并调节其体温。使用红霉素眼膏覆盖小鼠眼球表面，以保持眼球湿润。
4. 使用门齿杆和耳杆将小鼠头部固定在立体定位仪上。（图1A）。
5. 使用剃刀去除头部顶部的毛发。用碘伏和75%乙醇交替擦拭头部皮肤三次进行消毒。出于伦理考虑，除手术部位外，其余身体部位应予以遮盖。使用手术刀从颈部基部至两眼之间做一条长约1 cm的正中矢状切口，暴露颅骨（图1B）。
6. 用含30%过氧化氢的无菌棉签轻轻擦拭颅骨表面，以清晰显示颅骨缝线（图1C）。调节门齿杆和耳杆的高度，使λ点与前囟点处于同一水平高度（即当针尖接触两点时，z轴坐标相同），从而使矢状缝保持水平。
7. 将微量注射器针头（10 µL，33 G）轻轻置于前囟点，并将x、y、z坐标归零（图1D）。根据数字读数提示，将注射器移动至注射位点（x: 1.04；y: 1.0，即中线外侧1.04 mm，前囟后方1.0 mm）（图1E）。
8. 使用1 mL注射器针头（26 G，0.45 mm）在注射位点缓慢钻出一个小的颅骨钻孔，注意不要穿透硬脑膜（图1F）。通过钻孔将微量注射器针头缓慢插入脑组织，直至达到特定深度（对于大多数P56小鼠，z = -1.62 mm）（图1G）。
   注意：根据经验，插入深度为-1.62 mm时，针尖可到达大多数P56小鼠胼胝体的中层，从而使溶血卵磷脂直接注入胼胝体，诱导脱髓鞘。
9. 以0.3 µL/min的速度注射1.5 µL的1%溶血卵磷脂溶液。注射完成后，等待5分钟，再缓慢拔出微量注射器，以防止液体沿针道泄漏。
10. 使用5-0外科缝线缝合皮肤（图1H）。
11. 将小鼠置于加热垫上，以防体温下降。每24小时皮下注射一次卡洛芬（5 mg/kg）以缓解疼痛。每日在伤口处涂抹红霉素软膏，确保伤口正常愈合。术后将小鼠单独饲养于笼中，并提供湿润食物，直至完全恢复。术后每日对小鼠进行监测。

2. 渗透泵的制备

注意： 泵的关键组件如图2A所示。

1. 确定脑部灌注套管插入脑内的深度。确保所使用的脑部灌注套管针长为 3 mm，每个深度调节垫片为 0.5 mm。为达到 1.5 mm 的注射深度（接近胼胝体），使用组织粘合剂将三个深度调节垫片固定在脑部灌注套管的针头上（图 2B, C）。
2. 为填充渗透泵，将泵包装中附带的注射器针头连接至 1 mL 注射器，并吸取药物。将泵垂直持握，将注射器插入泵顶部的开口，缓慢注入药物，注意避免产生气泡（见 图 2D）。当液体从开口处溢出时，缓慢拔出注射器。
3. 使用剪刀或镊子小心地从流量调节器上移除白色法兰，注意不要弯曲或压损流量调节元件。然后，将流量调节元件插入泵中（图 2E）。为判断渗透泵内是否存在气泡，应在填充前后分别称量渗透泵的重量。
4. 根据动物体型修剪导管至适当长度（对于体重约 25 g 的 P56 小鼠，使用 20–25 mm 的导管）。将导管连接至脑部灌注套管。
5. 使用注射器将药物注入导管，避免引入空气（图 2F）。
6. 将导管连接至流量调节元件。连接后，确保导管覆盖约 4 mm 的暴露流量调节元件部分（图 2G）。
7. 为确保渗透泵在植入后可立即工作，将填充好的泵浸入 37 °C 的无菌 0.9% 生理盐水或 PBS 中至少 4 至 6 小时（建议延长至过夜），以使泵表面的半透膜预先被与组织环境渗透压相同的溶液润湿（图 2H）。
8. 所有装入泵中的溶液均应无菌。ALZET 泵出厂时已灭菌，经过钴-60 的灭菌剂量处理。然而，若发生外部污染，可用 70% 水溶液异丙醇擦拭泵表面进行清洁。

3. 渗透泵的植入

1. 胼胝体脱髓鞘模型建立后等待3天。打开小动物麻醉系统。将剪刀、镊子和止血钳消毒后浸泡于75%酒精溶液中。在手术区域铺设无菌单。
2. 再次将小鼠麻醉并固定于立体定位仪上。用眼膏覆盖眼球表面，防止干燥。
3. 用75%酒精对原伤口进行消毒。打开此前缝合的手术切口（图3A），并将切口向肩胛骨方向扩大（图3B）。
4. 在肩胛骨处使用止血钳或镊子分离皮肤与皮下结缔组织，形成一个腔隙（图3C）。将渗透泵置入该腔隙中（图3D, E）。
5. 用棉签轻轻擦拭，暴露在建立脱髓鞘模型时于颅骨表面所制造的微孔（参见步骤1.8）。将脑部输注套管通过此微孔垂直插入，并立即使用组织粘合剂将其固定于颅骨上（图3F）。
6. 用剪刀剪除脑部输注套管上方的可拆卸标签（图3G, H）。或者，也可在插入套管前先移除标签，以避免此过程中产生震动。
7. 缝合切口或使用组织粘合剂封闭（图3I）。
8. 术后将小鼠置于加热垫上，防止体温下降。每24小时皮下注射5 mg/kg的卡洛芬以缓解疼痛。每日在切口处涂抹红霉素软膏，确保伤口正常愈合。将动物单独置于笼中，并提供湿润饲料，直至完全恢复。

结果

图1：溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘小鼠模型的建立。 （A）将小鼠固定于立体定位仪中。（B）沿中线矢状方向切开约1 cm切口，暴露颅骨。（C）观察颅骨缝。（D）以Bregma点为原点，重置x、y、z坐标为0。（E...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉空气泵	RWD	R510-29	E05818-006
脑部输注套件3	ALZET	8851	1-3 mm
卡洛芬	Macklin	C830557-1g	每24小时5 mg/kg
红霉素眼膏	Along technology	YCKJ-RJ-024780	麻醉期间覆盖眼球表面
红霉素软膏	pythonbio	RG180
气体抽排装置	RWD	R546W	E05518-002
L-α-溶血磷脂酰胆碱	Sigma	L0906	用无菌PBS溶解至1%
微量注射器	Hamilton	65460-05	注射器型号：1700，10 µL，33号针头
微型渗透泵型号1002	ALZET	4317	每小时0.25 µL，持续14天
PBS（pH = 7.3）	ORIGENE	ZLI-9061
戊巴比妥钠	上海西碧	CAS NO: 57-33-0	腹腔注射150-200 mg/kg用于安乐死
小动物麻醉机	RWD	R520IE	E05807-006 M
立体定位仪	RWD	E06382
STERI 250灭菌器	Keller	31101	手术器械快速灭菌
外科缝合线	上海金环	F504	5-0
注射器针头（1 mL）	上海KDL	6930197811018	26号（0.45 mm x 16 mm）
待测药物及溶剂	根据实验而定	N/A
Thermostar恒温监测系统	RWD	69026	维持麻醉期间体温
Vetbond组织粘合剂	3M	1469SB	固定脑部输注套管并闭合皮肤切口