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所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际有关人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。
1. 受试者选择
- 研究方案的患者筛选。
- 确定具有活动性癫痫（过去一年内有癫痫发作）或远期癫痫史（既往有癫痫发作，但过去五年内无论是否用药均无发作）且脑结构影像显示室管膜下结节状异位的患者。
- 排除无任何癫痫发作史的患者。同时排除癫痫发作可能由其他病因引起者（e.g., 有创伤性脑损伤、脑卒中、脑膜脑炎病史）或脑电图（EEG）表现符合其他诊断者（e.g., 特发性全面性癫痫、内侧颞叶癫痫）。
- 排除合并其他神经系统或精神疾病，或存在任何其他不稳定医学状况的患者。同时排除既往有脑部手术史、无法耐受磁共振成像（MRI）、近期使用非法药物或大量饮酒，或存在特定MRI或经颅磁刺激（TMS）禁忌证的患者。
- 健康对照受试者的选择。
- 针对每位室管膜下结节状异位（PNH）患者（在我们先前已发表的研究中，共8例患者，年龄20–43岁，平均30.25岁；男性3例，女性5例），匹配一名年龄和性别相同的健康对照。
- 排除患有任何活动性神经系统或精神疾病、正在使用精神活性药物、存在其他不稳定医学状况、有既往脑部手术史、无法耐受MRI、使用非法药物或大量饮酒，或存在任何其他特定MRI或TMS禁忌证的受试者。
2. 生成刺激靶点
- 使用3T MRI系统，采用T1加权序列获取高分辨率全脑结构切片图像。采用以下采集参数：每 slab 128 层切片，矩阵大小为 256 × 256，视野（FOV）256 mm，层厚 1.33 mm，层间间隙 0.63 mm，体素尺寸 1 × 1 × 1.33 mm3，重复时间（TR）2,530 毫秒，反转时间 1,100 毫秒，回波时间（TE）3.39 毫秒，翻转角 7°。
- 使用3T MRI系统，采用对血氧水平依赖（BOLD）对比敏感的平面回波序列采集静息态功能图像。扫描过程中，指导受试者保持清醒静息状态，睁眼，不执行任何特定任务。采用以下采集参数：FOV 256 mm，体素尺寸 2.0 × 2.0 × 2.0 mm，TR 6,000 毫秒，TE 30 毫秒，翻转角 90°，采集时间 6.4 分钟。
- 使用MRICroN软件识别结节状异位的各个独立区域（可以是单个结节，或无法分离的连续结节簇）。在T1加权结构图像的轴向切片上，逐层使用“画笔”工具手动勾画异位灰质区域的兴趣区（ROIs）。
- 使用CONN功能连接软件工具箱对静息态功能数据进行四个顺序处理步骤：设置（Setup）、预处理（Preprocessing）、分析（Analysis）和结果（Results）。
- 在“设置”步骤中，通过菜单选项创建新项目并输入基本实验信息。加载每个受试者的功能图像，并将其重新对齐并共配准至解剖图像。
- 加载结构图像。加载在步骤2.3中创建的异位灰质ROI文件。输入实验条件的详细信息；由于这是静息态数据，输入一个单一条件，起始时间为0秒，持续时间等于每次扫描的总时长。工具箱将提取异位灰质ROI的BOLD时间序列。检查是否存在可能的不一致。
- 在“预处理”步骤中，BOLD信号变异的混杂因素包括呼吸引起主磁场的调制、心脏搏动以及受试者运动。通过集成的基于主成分分析的方法去除混杂因素，该方法分析不太可能与神经活动相关的区域（如脑室和大血管）的时间序列数据，以识别生理噪声过程。预览每个可能混杂因素所解释的总方差。应用带通频率滤波（0.01 Hz < f < 0.1 Hz）和高斯平滑（半高全宽6 mm）。
注意：工具箱默认会识别可能的混杂因素来源，包括白质和脑脊液中的BOLD信号以及重对齐参数（受试者运动）。 - 在“分析”和“结果”步骤中，将异位灰质ROI设为感兴趣源。预览相关性（而非回归）的连接度量，并使用相关系数的阈值进行显示。
- 对每位受试者，以每个独立的异位灰质区域作为种子ROI，生成种子点至体素的连接图，展示该ROI的平均BOLD信号时间序列与大脑其他每个体素之间的相关性。
- 进行被试间或源间对比的二阶分析（可选）。使用高度（体素水平）和范围（簇水平）阈值显示结果；同时显示未经校正和经假发现率校正的p值。
- 使用MRICroN软件，利用“画笔”工具手动勾画两个经颅磁刺激（TMS）的目标区域：一个为“连接目标”，另一个为“非连接目标”。使用“叠加”（Overlay）功能，将上述生成的功能连接图叠加到每位受试者的结构图像上。
- 确保“连接目标”是皮层中与上述灰质异位具有显著功能连接的区域；确保“非连接目标”是大小相似、但与任何异位灰质ROI均无显著功能连接的区域，且在皮层表面上距离“连接目标”至少2.5 cm，以尽量减少TMS过程中邻近区域刺激效应的风险。
- 选择目标时应尽量降低TMS诱发伪影的可能性。特别应避免选择外侧颞叶或额极区域作为目标，因为这些区域容易引发明显的肌肉收缩和/或眼球运动伪影，从而掩盖早期TMS-EEG信号。将勾画的目标保存为新的目标ROI。
- 确定每位受试者每个目标ROI的MNI（蒙特利尔神经学研究所）坐标，然后利用这些坐标在每位受试者匹配的健康对照受试者中定位相应的两个目标位点。
3. TMS-EEG 实验设置
- 将结构扫描图像（通常为高分辨率T1加权3D容积图像）上传至神经导航系统。
- 使用神经导航软件，在图像上标记所需靶点。同时标记用于配准及刺激过程中神经导航的外部解剖标志点（鼻根点、双侧耳前点）。若使用带有可旋转电极和电极导线的脑电帽，请将导线方向调整为垂直于经颅磁刺激线圈的长轴52。
- 在实验开始前联系受试者，提醒其在经颅磁刺激-脑电图（TMS-EEG）当天不要使用护发素或其他护发产品（洗发水可以使用），在TMS-EEG前一天晚上避免饮酒，并在TMS实验前摄入日常习惯的咖啡因剂量。
4. 实验环节
- 确认受试者符合经颅磁刺激（TMS）安全标准，最好通过结构化问卷进行评估。确认受试者前一晚未饮酒，未显著增加或减少日常咖啡因摄入量，未在前一晚使用可能改变皮层兴奋性的非处方助眠药物（如苯海拉明），并获得了通常时长的睡眠（因为睡眠剥夺可能增加皮层兴奋性）。
- 让受试者坐在一把舒适的椅子上。
- 将脑电帽佩戴在受试者头部并准备电极。
- 测量受试者的头部，并选择合适尺寸的脑电图（EEG）帽，以帮助实现较低的电极阻抗。
- 使用棉签和酒精彻底清洁每个电极下方的皮肤。
- 在每个电极上添加导电凝胶。注意不要添加过多凝胶，以免凝胶在电极间泄漏，形成导电桥，导致不同电极之间出现共用信号。
- 如有必要，在添加导电膏后，可尝试按压每个电极，以确保头皮、导电膏与电极之间接触良好。为尽量减少充电伪迹，应确保导电膏不溢出电极固定器外。均匀降低导电水平，以最小化记录伪迹。
- 将参考电极和接地电极尽可能远离刺激线圈放置，以最大限度地减少经颅磁刺激（TMS）诱发的电极伪迹污染整个记录信号的可能性。建议将这些电极置于骨性结构上方，位于皮质活动较少、可视为“非活跃”区域的部位。
注意： 即使在目标区域可变的研究中，前极区也极少被选为刺激靶点，因为对该区域进行经颅磁刺激（TMS）可能引发明显的眼球运动、额肌和面部肌肉收缩，并经常导致头皮疼痛和头痛；因此，刺激这些区域时的TMS-EEG信号常被大幅伪迹所掩盖。 - 由于这些区域不太可能被选为刺激靶点，因此可将参考电极和接地电极置于前额。将它们放置在相距几厘米的范围内，以最大限度减少共模噪声。
注意： 当所有刺激靶点均位于一侧半球时，可选择对侧乳突作为另一选项。 - 检查电极阻抗，步骤如下：将脑电图（EEG）输出电缆插入EEG记录系统的“阻抗”接口，然后按下EEG系统上的“测量阻抗”按钮。确保电极阻抗不超过5 kΩ。
- 在对侧手准备肌电图电极（使用第一背侧骨间肌或拇短展肌；在同一项研究中，所有受试者应使用相同的肌肉）。
- 为受试者提供耳塞，以降低听力损失和耳鸣的风险。
注意： 另一种选择是在整个记录过程中使用耳机播放白噪声或有色噪声（其频谱特征与TMS咔嗒声相匹配），音量需足以掩盖TMS产生的听觉咔嗒声；这种方法还有一个额外优势，即能最大限度减少TMS诱发的听觉诱发电位带来的潜在混杂因素。需要注意的是，在线圈与头皮之间放置一层薄泡沫也有助于最小化听觉诱发电位。 - 将红外探测器放置在受试者头部，确保探测器的安置方式能够尽量减少实验过程中发生移动的风险。
- 使用神经导航设备附带的探针，在受试者身上确定预选的外部解剖标志点（第3.2节）的位置，将受试者头部与MRI图像进行配准。
- 通过在其他部位施加脉冲刺激，使受试者适应刺激感受例如，受试者的手臂），或通过施加一个低强度刺激脉冲（例如， 5% 最大刺激输出）施加于头皮。
- 确定静息运动阈值（在10次刺激中有5次能诱发出至少50 µV大小的运动诱发电位的最小刺激强度）。其中一种方法为相对频率法，具体如下。
- 确定受试者大脑半球上运动皮层的位置，该半球与基于fMRI连接性的靶点同侧。使用神经导航时，通常位于中央前回的“欧米伽”（Omega）区域。将线圈垂直于脑回放置，手柄朝向枕部。
- 从预计低于阈值的刺激强度开始刺激（例如， 35% 最大刺激器输出。
- 以5%最大刺激输出为步长逐步增加刺激强度，直至经颅磁刺激（TMS）稳定诱发出具有特定幅值的运动诱发电位（MEPs） > 每次试验中为 50 µV。
- 然后以最大刺激输出的1%为步长逐步降低刺激强度，直至在10次刺激中记录到少于5次阳性反应。
注意： 将此刺激强度加1定义为运动阈值。或者，采用自适应阈值技术，以较少的刺激次数确定运动阈值。
- 为刺激目标区域，将经颅磁刺激（TMS）强度设置为所需数值（例如，120% 静息运动阈值
注意： 然而，在头皮-皮层距离存在显著区域性差异的情况下（例如， 对于额叶萎缩的患者，这种技术可能导致低于阈值的刺激。或者，借助能够实时估算诱导电场的适当神经导航系统，刺激强度也可根据皮层表面计算出的诱导电场（单位：V/m）设定为特定的振幅。 - 使用神经导航软件对每个目标区域施加单次TMS脉冲，脉冲之间采用可变间隔，以最小化皮层可塑性和受试者预期效应例如， 每4至6秒一次，间隔至少3秒，以避免累积效应。为最大程度保持一致性，应将线圈垂直于下方脑回的长轴放置，线圈手柄指向后外侧。