向大鼠中枢神经系统鞘内递送测试化合物

摘要

来源：Chen, Y., et al．大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送．J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了通过植入大鼠模型腰椎脊柱的导管，将测试化合物递送至脑脊液（CSF）中的过程。该化合物随脑脊液循环到达脑和脊髓，进入神经元，具有治疗潜力。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 手术

1. 用50 mL锥形管支撑大鼠，辨认骨盆上方肌肉之间的两个天然凹陷处（图中箭头所示） 图1A）。用一只手固定住这些凹陷处，另一只手从尾侧向头侧方向轻柔按压并触摸脊柱，找到椎骨之间的第一个明显凹陷，即为第一骶椎（S1）与第六腰椎（L6）之间的椎间隙（图1B).
2. 向头侧稍作移动，以识别下一个凹陷处，即腰椎5（L5）与L6椎骨之间的椎间隙，以及注射位点（*在 图1A使用手术刀沿中线从头侧至尾侧在皮肤上做一个不超过2 cm的切口，使注射部位位于切口中心（图中虚线所示） 图1A).
3. 使用解剖剪去除结缔组织，以暴露肌层。随后，在L6腰椎棘突外侧的肌膜上做一长度为1 cm的切口。
   注意： 此时可观察到L6腰椎的骨骼。
4. 将导向套管-针组件置于第6腰椎前侧附近，沿第6腰椎前侧推入椎间孔，使针尖穿入椎管。沿针芯插入导向套管至预定位置，随后拔出23号针芯，仅保留导向套管在位。
   注意： 使用钝头镊子在插入针头前定位第6腰椎（L6）的背侧突起是有帮助的。通常，可观察到脑脊液（CSF）进入针芯（该液体可能略带血色，但这并不表示已造成损伤或针头位置不正确）。作者在该操作过程中未观察到大量出血或严重出血情况。若出现上述任一情况，应联系兽医以确定适当的处理措施及是否需要对动物实施安乐死。
5. 将导管-导丝组件插入引导套管中。将导管-导丝组件以约45°角向下倾斜进入椎管，并用力将其末端推进椎管内约0.3 cm。
6. 移除导向套管，保留带有导丝的导管。将导丝从导管的鞘内端向外抽出约2.5 cm，然后向前推进导管进入椎管，直至导管上的2 cm刻度线到达椎管入口处（刚好可见于肌肉下方），如图所示。 图 2Bvi.
   注意： 插入的导管应向前上方延伸至蛛网膜下腔。成功置管后，导管应在该腔隙内自由移动。
7. 完全撤出导丝，可见脑脊液进入植入的导管。
8. 通过30 G针头端将输送导管组件连接至植入导管的远端图2Bv，vi).
9. 将60 µL无菌生理盐水注入一支100 µL注射器（冲洗用注射器）中。将30 µL测试化合物（例如反义寡核苷酸或ASO溶液）注入第二支注射器（注射用注射器）中。
10. 将装有生理盐水的冲洗注射器连接至输送导管组件的管路适配器端图 2Bv注入20 µL无菌生理盐水至鞘内腔（注射前冲洗）。
11. 将装有测试化合物的注射器连接到给药导管组件的管路接头端图 2Bv注入30 µL待测化合物至鞘内腔，持续30秒。
    注意： ASO的常规注射体积为30 µL，以在脊髓和皮层中实现良好的基因敲低效果。已有报道指出，注射体积可能影响化合物的分布，但不同注射体积尚未经过系统测试。若使用其他化合物或注射体积，其安全性和有效性需通过实验确定。
12. 重复步骤 1.10，用另外 40 µL 无菌生理盐水冲洗导管（注射后冲洗）。然后将给药导管组件从植入式导管上拆下。
    注意： 注射前和注射后的冲洗被认为可以减少化合物的局部滞留，并促进其向头端结构的分布。
13. 为无菌剪切并热封植入的导管，将一对无菌解剖镊置于干热灭菌器中加热至高温，然后用镊子的热端夹紧导管管壁。
    注意： 此操作会使导管熔化，从而使管壁上的孔洞闭合，管壁各侧相互黏附，以无菌方式封闭导管。随后将其置入皮下空间。
14. 使用可吸收单丝缝线将剩余的热封导管固定于结缔组织。然后，使用不可吸收单丝缝线缝合皮肤，覆盖已固定的热封导管。
    注意： 伤口夹也可根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案使用。该技术适用于重复注射，但在本实验室仅用于单次注射。重复注射的可行性需在IACUC批准的前提下通过实验进行评估。
15. 使用纱布和生理盐水清洗皮肤上的血液，并将动物置于加热培养箱中，使其从麻醉状态恢复至能够自主活动，随后将其放回饲养笼（每笼两只大鼠）。
    注意： 同一天对多只大鼠进行手术时，每只动物之间需用水清洗器械以去除血液，并使用加热的干珠灭菌器重新灭菌（至少20秒，并留出冷却时间）。每5只动物更换一套新器械。
16. 根据IACUC方案，术后至少每天监测动物3天，并在术后继续每周进行监测。

结果

图1：注射位点与切口线的确定。 （A）用一个50 mL锥形管支撑大鼠腹部，可清晰看到骨盆上方肌肉之间的两个凹陷处（箭头所示）。（B）用一只手固定这两个凹陷处，另一只手轻轻按压并触诊脊柱，找到L5与L6椎骨之间的椎间隙，即为注射位点（图A中标注的*处）。图A中的虚线表示以注射位点为中心的切口线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD intramedic PE 导管	BD	聚乙烯导管 PE50，直径 0.023 英寸	BD 427400 (10 英尺，Fischer Scientific 22-204008) 或 427401 (100 英尺，Fischer Scientific 14-170-12P)
BD intramedic PE 导管	BD	聚乙烯导管 PE10，直径 0.011 英寸	BD 427410 (10 英尺，Fischer Scientific 14-170-11B) 或 4274011 (100 英尺，Fischer Scientific 14-170-12B)
BD PrecisionGlide 一次性针头 30G	BD		BD 305128
引导套管	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25 mm) 针头	BD 305186
Hamilton 100 µl 注射器	Hamilton 公司	Hamilton 100 µl 注射器
热珠灭菌器	Fine Science Tools		灭菌器型号 FST 250
聚维酮碘消毒液	PDI		S48050
生理盐水	Baxter	氯化钠 0.9% 静脉输液 BP 50 ml	FE1306G
手术刀	Feather	一次性手术刀	No. 10
小型动物加热垫	K&H Manufacturing		型号 1060
套管芯丝	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
手术巾单	Dynarex		4410
手术剪刀和镊子	FST 和 Fisher Scientific
缝合线	Ethicon		4-0 或 5-0
本实验所用预制成型且已灭菌材料的替代来源
给药导管系统	SAI Infusion Systems		RIDC-01
引导套管	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
内导管	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
套管芯丝	SAI Infusion Systems		RIDC-STY