使用定位装置将siRNA递送至小鼠脑部的鼻内给药方法

摘要

来源：Ullah, I., et.al. 一种用于小鼠经鼻递送siRNA至中枢神经系统时固定体位的装置。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种精确的经鼻给药技术，用于通过特制的定位装置将靶向神经元的肽-siRNA 复合物递送至小鼠脑部。将麻醉后的小鼠固定于头朝下并前倾的位置，以优化 siRNA 的吸入效果并防止其流入肺部。靶向肽可促进神经元中受体介导的摄取，从而实现脑内 siRNA 的靶向递送及基因沉默。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小鼠体位摆放

1. 通过足底反射（用力捏压脚趾）评估麻醉水平，以维持手术所需的麻醉深度。

2. 将定位装置放置在适当的距离和高度，以便方便地接触所有必需的试剂。

3. 小鼠完全麻醉后，用拇指和食指轻轻提起每只小鼠颈背部的皮肤，将其放置在指定的椅子上。

4. 此阶段小鼠在固定架上的正确位置至关重要。将小鼠背部与固定架的背板平行放置，并使其与椅座呈90°角。松开双手，让动物自然处于头向下并前倾的位置，不要施加推压，如图1B所示。确保小鼠前肢在该放松姿势下能提供自然支撑，且动物无任何不适。

5. 小鼠正确放置后，用固定带将其固定在位，并立即开始鼻内接种。

2. 鼻内（IN）给药

注意：本方案描述了使用小鼠固定装置经鼻内（IN）递送RVG9R:siRNA复合物的方法。按照本方案，可将最多20-30 µL的溶液以每滴2 µL的方式轻松给予每只小鼠。该体积小于小鼠鼻腔容积（0.032 cm³），因此该操作不会导致致死性鼻孔阻塞或窒息。本方案允许同时对至少四只、最多八只小鼠进行接种（每台装置），从而实现时间优化并减少实验变异性。

1. 取10 µL微量移液器，并将其调整至2 µL。

2. 用 2 µL RVG9R:siRNA 复合物溶液上样微量移液器（例如，递送实验中使用 5.2 µg siCy5 与 104 µg RVG9R 复合，沉默实验中使用 13.5 µg siSOD1 与 270 µg RVG9R 复合，最终体积为含 5% 葡萄糖的 25 µL PBS）。

3. 用惯用手持移液器时，将肘部放在台面上以调整位置。用另一只手托住持移液器的手，以避免给液过程中产生不受控制的移动。

4. 将约 2 µL 的液滴置于靠近一侧鼻孔的位置，使小鼠能够直接吸入该液滴（参见图 1B）。如果难以形成微小液滴，则更换新的移液器吸头并重复操作。使用秒表确认接种之间的时间间隔。

5. 该设备可同时处理至少四只小鼠。若需要另一组小鼠重复步骤 2.4，可在第一组四个椅子的上方或下方设置另一个带有四个椅子的横杆，以便该设备可同时容纳最多八只小鼠。

6. 首次接种后 3-4 分钟，对另一侧鼻孔重复步骤 2.4。该时间间隔足以使小鼠完成首次剂量的吸入并恢复正常的呼吸。若因小鼠鼻孔意外喷出导致吸入的液滴脱落，需额外重新接种 2 µL 溶液。

7. 交替鼻孔重复整个过程，直至完成 20–30 µL 剂量。整个接种程序大约需要 30–45 分钟完成。

8. 在将小鼠放回指定笼子之前，将其眼睛涂上湿润的药膏。
注意： 在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得让其无人看管。

结果

图1： 使用定位装置进行鼻内接种操作的摄影图示。（A）鼻内接种所需的实验设备。（B）动物头部向下并前倾固定于装置上（左），以及进行鼻内接种时沉积2 µL液滴的操作（右）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠品系
Balb/c	Orient Bio	N/A	6–8 周龄，20–30 g
多肽
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
软件、算法与设备
小鼠固定装置	Signet Biotech	N/A
寡核苷酸与引物
siSOD1	ST Pharm	N/A	正义链：5’- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’
SOD1 引物	ST Pharm	N/A	F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’