芯片上的无透镜荧光显微镜技术

摘要

展示了一种无透镜片上荧光显微成像平台，可利用基于压缩采样的解码算法，对例如>0.6–8 cm²的超大视场内的荧光物体进行成像，分辨率<4μm。这种紧凑型宽视场荧光片上成像方式在高通量细胞计数、稀有细胞研究和微阵列分析中具有重要应用价值。

摘要

片上无透镜成像技术通常旨在用更简单、更紧凑的设计取代体积庞大的基于透镜的光学显微镜，尤其适用于高通量筛选应用。这一新兴技术平台借助新颖的理论和数字重构算法，有望消除对笨重和/或昂贵光学元件的需求。在此基础上，我们展示了一种片上荧光显微成像模式，无需使用任何透镜、机械扫描装置或基于薄膜的干涉滤光片，即可实现例如<4μm的空间分辨率，成像视场（FOV）超宽，可达>0.6-8 cm²。在该技术中，荧光激发通过棱镜或半球形玻璃界面实现，激发光源为非相干光源。激发光与整个样品体积相互作用后，在样品微流控芯片底部通过全内反射（TIR）过程被抑制。被激发样品发出的荧光信号则由光纤面板或锥形光纤收集，并传输至光电传感器阵列（如电荷耦合器件（CCD））。通过采用基于压缩采样的解码算法，所获取的样品无透镜原始荧光图像可被快速处理，从而获得例如<4μm分辨率、视场>0.6-8 cm²的高质量图像。此外，利用同一无透镜片上显微平台，还可成功成像垂直堆叠的微通道（例如通道间距为50-100 μm），进一步提升了该成像模式的整体通量。这一紧凑型片上荧光成像平台结合快速压缩解码算法，在高通量细胞计数、稀有细胞研究及微阵列分析中具有重要应用价值。

方案

在本节中，我们将回顾无透镜片上荧光显微镜平台的实验方法^1-4。为了展示该技术的能力，我们将呈现针对荧光微粒和标记白细胞的片上成像结果。尽管此处未予讨论，相同的无透镜荧光显微镜平台也可用于成像小型模式动物，例如转基因C. elegans样本³。

1. 无透镜片上成像平台的设计

我们的无透镜片上成像平台包含多个光学组件，包括数字传感器阵列（例如CCD芯片）、非相干照明光源、棱镜、吸收滤光片以及光纤面板或光纤锥。如图1所示，这些组件与微流控装置集成，可在芯片上实现大样本体积的荧光成像，且无需使用任何透镜、机械扫描装置或基于薄膜的干涉滤光片。

1. 数字传感器阵列： 我们的无透镜成像系统利用光电传感器阵列记录目标微小物体的荧光发射。在此平台上，为检测荧光信号，可采用多种类型的传感器阵列，例如电荷耦合器件（CCD，如型号：KAF-8300、KAI-11002、KAF-39000，均来自KODAK）和互补金属氧化物半导体成像器（CMOS，如型号：MT9T031C12STCD，来自Micron Technologies）。这些传感器阵列的关键参数包括像素尺寸（例如 5.4 μm, 9 μm, 6.8 μm 和 3.2 μm 对于KAF-8300、KAI-11002、KAF-39000和MT9T031C12STCD分别为）以及有效成像区域（例如，2.4 cm²，8 cm²，18 cm² 和 32 mm² 对于KAF-8300、KAI-11002、KAF-39000和MT9T031C12STCD而言，分别对应上述参数。对于无透镜片上成像，通常优先选用CCD传感器以实现更高的通量（更大的有效面积）和更优的灵敏度，而CMOS传感器则因其成本较低、重量较轻，在便携式设计（例如用于现场检测）中更具优势。
2. 光源： 在我们的平台中，可使用非相干光源（例如，简单的发光二极管（LED，如 Thorlabs 的 M455L2-C2 和 LEDD1B））进行荧光激发。在图1所示的实验装置中，一根芯径为1 mm的多模光纤（Thorlabs，BFH37-1000）直接与LED光源对接（无需使用任何透镜或耦合光学元件），激发光通过该光纤的出口孔径传输至样品区域。在此系统中，对于一个视场（FOV），荧光激发所需的功率水平应约为 ~0.2–5 mW > 2-8 cm² 在照明光纤的出口处；然而，由于直接耦合方法具有较大的损耗，会降低光纤输出端的激发功率，因此LED应能够输出约5 mW至1 W的功率水平。为了实现对多种染料的激发，还可通过使用光纤耦合器对不同颜色的LED进行复用。
   除了芯片上的荧光成像外，该平台还可通过使用垂直照明光源（如图2所示）获取同一样本的无透镜全息透射图像。与荧光激发所用的光纤不同，全息成像采用另一根纤芯尺寸更小（例如 ~50-400 μm) 与另一个LED光源（Mightex, FCS-0625-000）进行端面对接耦合。该垂直照明光在从光纤端面出射后，在传播至样品的过程中逐渐获得部分空间相干性。这种空间相干区域的直径与光传播的距离成正比，与光纤出射孔径的尺寸成反比。只要在样品平面上的空间相干光斑直径大于传感器平面上每个样品的衍射尺寸，来自各个物体的散射光便能与背景光发生真实干涉，从而生成样品的无透镜同轴全息图。这些采集到的无透镜全息图随后可通过迭代相位恢复算法快速处理，以重建出样品体积的透射式明场图像。^5-7由于用于阻挡激发光的吸收滤光片是截止波长通常为500-600 nm的高通滤光片，因此在此全息照明端选择较长波长的LED（即~625-700 nm），以便无阻碍地获取样品的透射式同轴全息图。
3. 其他光学元件： 在此片上荧光显微平台中，并行采用两种不同的激发光滤光方法，以产生所需的暗场背景，如图2所示。首先，使用玻璃棱镜（例如 Edmund Optics 的菱形或鸽形棱镜）或玻璃半球，在承载待测样品的微流控芯片底面产生全内反射（针对激发光）。与此同时，使用一种低成本的吸收滤光片（例如 Roscolux 产品）去除未遵循全内反射（TIR）过程而发生微弱散射的激发光。通过上述两种机制成功抑制激发光后，仅有样品的荧光发射信号被探测器平面接收。需注意的是，部分发射的荧光信号在同一界面也会经历全内反射。然而，这仅使该无透镜片上成像方法的检测数值孔径限制在约1.0，因此仅高于该高数值孔径的倾斜光线被限制在微芯片内部，而其余荧光光线仍可到达传感器阵列的感光区域，并被其像素采样。
   尽管具有如此大的检测数值孔径，传感器阵列上的原始荧光斑点仍变得相当宽（例如，~150-200 μm由于荧光发射不具备方向性，因而会迅速发散。为了在无透镜平台上设计并更好地控制这种荧光信号的空间扩展，我们采用了一种平面光学元件，即光纤面板（例如 Edmund Optics，NT55-142），将其置于样品平面与传感器平面之间。光纤面板由二维排列的光纤束组成，可将光强信息从器件的一侧传输至另一侧。在我们的片上无透镜显微成像系统中，其主要功能是将样品体积内荧光发射的自由空间模式耦合为在每根光纤中传播且无空间发散的导波光信号，从而部分压缩无透镜荧光点扩散函数（PSF）在样品平面与探测器平面之间的展宽。这进一步提高了我们系统的信噪比（SNR）以及利用该无透镜平台所能实现的空间分辨率。
   作为常规面板的替代方案，我们还可以在片上成像平台中使用一种“锥形”光纤面板，其顶面的光纤束密度显著高于底面。这种锥形面板不仅有助于我们实现更优的点扩散函数（PSF），还能在平台上引入放大效应（例如 >2-3倍），这有助于我们将无透镜分辨率进一步提高到例如 <4 μm需要注意的是，与基于普通面板的成像系统相比，此类锥形设计的视场至少会因引入的放大倍数的平方而减小，例如可能从约 8 cm 减小² 视场初始值（CCD：KAI-11002）降至 <2 cm² 与锥度一致。
   最后，我们还应注意，由于光纤阵列存在多种光学模式，使用光纤面板或光纤锥会扭曲样本的无透镜全息图。³尽管探测器阵列上这种失真的无透镜成像图案在某些细胞计数相关应用中仍具有实用性，但在片上组装结构中需要移除光纤阵列（例如端面面板或锥形光纤），以便进行透射图像的全息重建，尽管这会略微降低荧光模式下的空间分辨率³.
4. 微流控芯片： 我们平台所使用的微流控芯片是通过在载玻片上放置聚二甲基硅氧烷（PDMS）壁制成，以形成芯片成像所需的微通道。制备这些微流控通道的步骤如下：
   1. PDMS A 和 B 弹性体按 1:10 体积比均匀混合并搅拌。
   2. 一旦将该非均相溶液倒入培养皿中，即进行固化处理 65 °C 2小时。
   3. 使用X-acto刀从培养皿中切出所需尺寸和形状的微流控通道壁。
   4. 然后使用高频等离子发生器（Electro-Technic Products Inc., BD-10AS）实现器件键合，该过程需将盖片玻璃和PDMS键合区域均暴露于等离子处理中。
   5. 等离子处理后，将器件置于烘箱中，在约40-50分钟内 70 °C 以增强结合力。
5. 无透镜片上显微成像平台的组装与校准：
   我们无透镜片上成像平台的组装步骤可详述如下：
   1. 移除光电传感器阵列的盖玻片。
   2. 使用真空笔（Edmund Optics，NT57-636），将一片薄吸收滤光片轻轻放置在探测器的有源区域顶部。
   3. 在该吸收滤光片上方放置一个光纤面板或锥形光纤。
   4. 将制备好的微流控芯片直接放置在光纤阵列的顶部。
   5. 使用折射率匹配油（Cargille，浸油300系列），将玻璃棱镜或半球组装在微流控芯片上方，使界面的折射率与玻璃的折射率相匹配。
   6. 侧向照明光纤被移至靠近棱镜（或半球）的位置，并调整其角度，以确保在对应于微流控芯片底部基底的玻璃-空气界面处发生全内反射。垂直照明（用于无透镜透射成像）被调整至与探测器阵列垂直，并对准至所需的视场中心。
   7. 侧向和垂直光源依次开启和关闭，以在同一芯片平台上实现荧光成像和明场透射成像。
   8. 然后通过一台个人电脑（例如，3.2 GHz 处理器，Intel Core），使用自行开发的 Labview 界面采集无透镜原始图像。

2. 样品制备

我们使用荧光微珠（例如 Invitrogen 的 Fluospheres）来校准成像平台，方法是测量其无透镜系统的点扩散函数（PSF）。完成初始的 PSF 测量后，可利用相同的片上平台对各种细胞或小型模式动物（例如转基因 C. elegans 样品）进行成像。

从下一小节开始，我们将详细介绍样品制备步骤。

1. 荧光微珠：
   1. 将原始荧光微珠溶液与去离子水混合，以优化样品浓度。
   2. 分别将约 10 μL 荧光微珠溶液与 40 μL、5 mL 和 20 mL 的去离子水混合，用于直径为 10 μm、4 μm 和 2 μm 的微珠。根据需要，通过将不同类型的微珠溶液（例如，非荧光和荧光微珠）相互混合，制备多种微珠的异质溶液。
   3. 然后使用锐利的注射器针头（Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Needles, 14-826 系列）从侧面 PDMS 壁将最终样品溶液注入微流控芯片中。
2. 白细胞标记：
   1. 将约 100 μL 全血与约 1 mL 红细胞裂解缓冲液（eBioscience）混合。
   2. 室温孵育约 3 分钟后，将裂解后的血液溶液离心，并将沉淀层重悬于约 200 μL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
   3. 为用荧光染料标记细胞的核酸，向 200 μL 重悬液中加入 5 μL 的 1 mM SYTO 16 染料，随后将样品在室温避光条件下孵育约 30 分钟。
   4. 对已标记的样品进行第二次离心，弃去上清液，以减少未结合染料产生的荧光背景噪声。
   5. 将白细胞沉淀层重悬于 PBS 中，随后可转移至微流控芯片，用于无透镜片上荧光成像（参见图 7）。

3. 无透镜荧光图像的数字处理

在此无透镜成像平台中，采用两种不同的算法通过数字方式提高系统的分辨率，即Lucy-Richardson 去卷积和基于压缩采样的解码。通过使用这些数字处理方法，我们通过分辨紧密排列的微珠成对结构量化了每种方法所能实现的分辨率提升（见图5-6）。重建后的无透镜荧光图像随后可进行伪彩处理（如需要），以突出微小物体的自然颜色，但这必须事先知道荧光信号的波长，除非使用彩色传感器芯片（例如，RGB：红-绿-蓝 CCD/CMOS）。对于这些数字处理方法，采用自主开发的算法，仅需中央处理器（例如，3.2 GHz 处理器，Intel Core）。未来，下一代图形处理单元（GPU）也可用于实现更快速的处理。此外，如有需要，还可通过自主开发的界面（见图8）对解码后的荧光物体进行自动计数，用于芯片上细胞计数应用。

1. 系统点扩散函数（PSF）的测量：
   在进行任何用于提高分辨率的数字处理（如去卷积或压缩解码）之前，需要估计片上系统的非相干点扩散函数。该函数可通过平均多个由位于传感器芯片某一高度处的孤立微小荧光微珠所产生的无透镜荧光图样来获得。这些单独的荧光图样随后根据其质心坐标进行对齐，并在适当强度归一化后进行平均^1,2。此平均后的无透镜图样即可作为我们片上显微镜的荧光点扩散函数。
2. Lucy-Richardson 去卷积¹： 为了在数字上提升平台的空间分辨率，我们将原始采集的荧光图像和测得的非相干点扩散函数输入到一种加速的 Lucy-Richardson 算法中^8-10。通过应用贝叶斯定理，Lucy-Richardson 算法利用测得的点扩散函数，迭代优化物平面荧光源分布的最大似然估计值^8,9。通常在出现噪声放大之前经过数百次迭代后终止迭代过程，以确保投影图样与实测无透镜荧光图样之间的均方误差最小。该去卷积算法的收敛性还通过向量外推法得以加速，从而缩短计算时间¹⁰。举例说明：该算法可在普通运行 Matlab¹ 的 PC 上，对约 8 cm² 的视场在几十分钟内完成去卷积，实现约 20 μm 的有效空间分辨率（使用像素尺寸约为 9 μm 的 CCD/CMOS 芯片）。需要注意的是，对于约 1 mm² 的视场，相同计算时间可缩短至几秒钟，这与典型 10X 物镜的视场大小相当。
3. 基于压缩采样/感知的稀疏信号解码²： 通过使用基于压缩感知/采样的解码算法^11,12，可进一步提高分辨率（可达 <4 μm）⁴。压缩采样/感知提供了一种新兴的理论框架^13-15，旨在从远少于采样定理所要求的样本数量中恢复稀疏信号。通常情况下，从欠采样测量中恢复信号是一个病态问题；但对于一类特定函数（即稀疏函数），最近研究表明，经典的采样定理及其表示基在所需测量数量方面效率较低，即相比经典采样理论，同一稀疏信号通常可从极少的样本中唯一恢复。
   我们片上显微镜记录的无透镜荧光图像本质上满足压缩解码的一个重要前提：对于本研究关注的应用，如宽场荧光细胞计数、稀有细胞分析和高通量微阵列成像，感兴趣的荧光物体可被视为天然稀疏。因此，在我们的无透镜荧光显微镜中，物平面上荧光发射体的分布及其相对强度的解码可建模为一个大规模的 l₁-正则化最小二乘问题，可通过例如内点法求解^2,12。该优化问题可数学表达为：
   
   其中 ||u||_k=(∑_iⁿ |u_i|^k )^(1/k) 且 ||u||_∞=max_i |u_i |。因此，我们最小化记录/测量值（y）与估计值（Ax）之间的无透镜图像差值的 l₁-正则化 l₂-范数，其中 x 和 A 分别表示待解码的源分布和利用系统实验 PSF 构建的测量矩阵。我们还引入一个约束函数，强制物平面上的源分布为非负值。当代价函数值达到预设的容差阈值时，该迭代压缩解码过程结束。正则化参数（β）和容差参数通常是物体稀疏性和测量噪声水平的函数，在我们的系统中分别优化为 ~βmax/10 和 ~0.01。
   基于上述数值方案，对原始荧光图像进行压缩解码显著提升了平台分辨稀疏物体的能力，且处理速度与 Lucy-Richardson 去卷积相当²。除了成像单一层外，通过使用对应于不同深度层的所有 PSF 并行运行同一算法，还可同时解码并分离位于不同深度的荧光物体²。
4. 伪彩着色： 尽管并非根本性限制，但所介绍的片上成像平台主要采用单色光电传感器阵列，这通常能为生物样本成像提供更高的信噪比。因此，原始荧光图像以灰度格式采集，不包含样本的真实颜色信息。这一问题可通过在无透镜成像架构中使用彩色 CCD/CMOS 芯片来缓解，从而在每次无透镜荧光测量中获取三个颜色通道（红、绿、蓝）。另一方面，若已知标记染料的发射特性，也可通过在 MATLAB 等环境中实现的伪彩算法，将单色传感器芯片获取的原始灰度荧光图像及其解码/去卷积版本人工转换为彩色图像。为此，可将采集的灰度图像扩展为三维数据立方体，通过在数据立方体的每个伪通道中使用适当的加权因子，合成任意所需颜色。经此处理后，单色无透镜荧光图像可根据需要转换为多通道图像，以呈现特定荧光物体的已知颜色信息。
5. 自动荧光细胞计数： 针对细胞计数应用，我们还开发了定制的用户界面（见图8），可根据片上显微平台采集的无透镜图像自动计数荧光物体/细胞。为此，首先对原始无透镜图像应用软阈值处理，以缩小潜在荧光物体的位置范围。然后，使用一系列函数（特别是 regionprops）测量每个感兴趣子区域的图像属性，如位置、面积、形状和强度。利用这些对象数据，将二值化对象分类为不同组别，如细胞、坏像素以及灰尘或背景自发荧光。一旦对 regionprops 函数的最终结果进行筛选，仅保留感兴趣的细胞，则可通过结果结构数组的长度获得整个无透镜片上成像器视场内的细胞总数。

4. 代表性结果：

我们的实验装置概览如图1所示，其中包含组装过程中使用的多种光学元件。图2解释了我们片上显微镜平台的关键特性，包括荧光激发与检测、全内反射，以及在同一平台上实现全息透射成像的非完全相干照明。含有多种微粒（4 μm绿色和10 μm绿色/红色）的异质混合物的无透镜荧光片上成像结果如图3-4所示。图5比较了Lucy-Richardson去卷积与基于压缩采样/感知的解码方法，用于数字增强原始无透镜荧光图像的分辨率。图6量化了压缩解码实现的空间分辨率（<4 μm）。荧光标记白细胞的无透镜片上显微成像如图7所示，同时提供了使用传统荧光显微镜拍摄的对比图像。最后，我们的自动荧光物体计数界面如图8所示。

图1. 显示了我们基于芯片的无透镜成像系统的整体装置，包含组装过程中使用的多个光学元件。

图 2. 显示了片上无透镜荧光成像平台的示意图（左图）。荧光激发通过菱形棱镜的侧表面利用非相干光源实现。同时展示了我们片上荧光成像平台的实验装置（右图）。微流控芯片内的全血样本（尺寸：2.5 x 3.5 x 0.3 cm）通过棱镜界面被激发，芯片与棱镜之间使用折射率匹配油进行组装。通过全内反射（TIR）和滤光片对激发光的抑制，只有标记血细胞的荧光发射被我们的CCD传感器芯片（KODAK 11002）在约2.5 x 3.5 cm的视场范围内记录下来。

图 3. 展示了含有 4 μm 和 10 μm 绿色荧光微粒混合物的宽场片上无透镜荧光成像。为便于比较，同时提供了 10X 显微镜物镜图像，其与本研究的无透镜荧光图像结果高度一致。

图 4. 展示了含有10 μm绿色和10 μm红色荧光微粒混合物的宽场无透镜荧光成像。我们的无透镜荧光图像与相同样品的10倍物镜显微镜图像具有良好的一致性。

图 5. 提供了针对不同间距的10 μm微珠对成像的Lucy-Richardson（LR）去卷积算法与基于压缩采样（CS）的解码算法的性能比较。第一行显示了无透镜的原始荧光图像。第一行的插图展示了使用10倍物镜获取的相同颗粒的显微镜图像对比。第二行展示了我们的压缩解码结果，而第三行展示了Lucy-Richardson去卷积结果。d、d_CS 和 d_LR 分别表示显微镜图像、CS解码的无透镜图像和LR去卷积的无透镜图像中颗粒中心之间的距离。

图6. 无透镜荧光原始图像的数字处理过程示意图。采用基于压缩采样的算法，通过分辨紧密排列的直径为2 μm的微珠对，实现<4 μm的空间分辨率。插图还显示了40倍显微镜物镜下的对比结果，与解码后的荧光图像高度一致。其中，d表示显微镜图像中微珠中心之间的距离，而d_CS表示压缩采样（CS）解码后的无透镜荧光图像中微珠中心之间的距离。

图7. 展示了荧光标记（SYTO 16）白细胞的无透镜成像。原始的无透镜图像通过基于压缩感知（CS）的解码器快速解码，其结果与使用10倍物镜在传统显微镜下获取的同一样本图像高度一致。

图 8. 展示了一个自行设计的荧光物体自动计数界面（在 MATLAB 中实现）。

讨论

我们展示了一种片上荧光显微镜平台，可在无需任何透镜、机械扫描或薄膜干涉滤光片的情况下，实现例如<4μm的空间分辨率，视场范围可达例如>0.6–8 cm²。该技术利用光纤面板或锥形光纤，将来自样品的荧光发射信号通过一束二维排列的光纤电缆阵列收集，再传递至CCD/CMOS芯片等光电传感器阵列。随后，通过基于压缩采样/感知的解码算法，快速处理所获得的无透镜图像，从而在<4μm分辨率和>0.6–8 cm²的视场范围内成像。这种紧凑型宽视场荧光成像平台在高通量细胞计数、稀有细胞研究以及微阵列分析中可能具有重要应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电荷耦合器件（CCD）	KODAK	KAF-8300
电荷耦合器件（CCD）	KODAK	KAF-11002
电荷耦合器件（CCD）	KODAK	KAF-39000
互补金属氧化物半导体（CMOS）	Micron	MT9T031C12STCD
高功率LED光源	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
高功率LED驱动器	Thorlabs Inc.	LEDD1B
光纤耦合LED光源	Mightex	FCS-0625-000
真空笔	Edmund Scientific	NT57-636
2、4、10 μm 荧光微球	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS裂解缓冲液1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16标记试剂	Invitrogen	S7578
光纤面板	Edmund Scientific	NT55-142
光纤锥形适配器	Edmund Scientific	NT55-134
棱镜	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
滤光片	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS弹性体	Dow Corning	Slygard 184