重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的分离与纯化

摘要

来源：Jain, R. W., et al. 用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简易高效制备与纯化. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了MOGtag（一种用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）研究的重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG））的分离与纯化过程。该方案包括细菌裂解、超声处理、离心及镍亲和层析，以获得纯化的MOGtag蛋白。该蛋白可用于多发性硬化模型中B细胞介导的自身免疫研究。

方案

1. 收获 MOGtag 蛋白

注意：在此阶段，细菌将产生大量 MOGtag 蛋白。为收获 MOGtag，首先使用 Triton X-100 缓冲液裂解细菌，随后进行超声处理。接着，MOGtag 从包涵体中释放，并用咪唑和胍进行变性，从而获得含有 MOGtag 蛋白的粗提蛋白溶液。

1. 取一例夜间培养物中的1 ml等分试样，转移至1.5 ml微量离心管中。在16,000 × g条件下离心1分钟以沉淀细胞，并弃去上清液。将该管标记为TO/N（诱导后），然后将细菌沉淀置于-20 °C冰箱中，用于后续SDS-PAGE分析（图2）。
2. 将培养物均匀分配至适合高速离心的250 ml瓶中，并从此步骤开始始终将其置于冰上。在4 °C条件下，以22,000 × g离心15分钟，沉淀细菌细胞。
3. 弃去上清液。将细菌沉淀保存于-20 °C，或继续进行步骤1.4。
4. 通过向60 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入60 µl Triton X-100和120 µl浓度为50 mg/ml的鸡卵清溶菌酶储备液，配制裂解缓冲液（含0.1 mg/ml鸡卵清溶菌酶、0.1% Triton-X（v/v）的磷酸盐缓冲液（PBS））。
5. 用总共30 ml裂解缓冲液重悬并合并步骤1.3中获得的所有细菌沉淀。将此液体转移至可承受高速离心的50 ml圆底管中。将该管置于30 °C水浴中孵育30分钟。孵育期间，振荡混匀两次以重新悬浮细胞。
6. 孵育结束后，将管置于冰....

结果

图1：制备高纯度MOGtag蛋白所需步骤的概述。 为获得MOGtag蛋白，首先将表达MOGtag蛋白的细菌培养至高密度，然后按照第1节所述，使用IPTG诱导其表达MOGtag。经过过夜培养后，裂解细菌，并通过一系列离心步骤，提取含有MOG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21 大肠杆菌 - pet32-MOGtag	Kerfoot 实验室		需要这些细菌来表达 MOGtag 蛋白。甘油菌种可根据要求提供。
LB 培养基（Miller 配方）	Bioshop	LBL407.1
氨苄青霉素	Bio basic	AB0028	将粉末溶于 50% 乙醇 / 50% H₂O 中，配制成 100 mg/ml 溶液，-20 °C 保存。
IPTG	Bioshop	IPT002.5	将粉末溶于 H₂O 中，配制成 1 M 溶液，-20 °C 保存。
鸡卵溶菌酶	Bioshop	LYS702.10	用 H₂O 溶解至 50 mg/ml，-80 °C 保存。
吐温-X100	Sigma	T-8532
磷酸盐缓冲液	Life technologies	20012-027	无需使用市售磷酸盐缓冲液，任何标准实验室自制的磷酸盐缓冲液均可满足要求。
氯化钠	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
咪唑	Bioshop	IMD508.100
盐酸胍	Sigma	G3272	纯度必须高于 98%。
0.5 M EDTA	Bioshop	EDT111.500
硫酸镍(II)	Bioshop	NIC700.500
His bind 树脂	EMD Millipore	69670-3	以 20% 乙醇 / 80% H₂O 保存于 4 °C。
无水乙醇	Commercial Alcohols	P016EAAN	根据需要用水稀释。
冰醋酸	Bioshop	ACE222.1
三水合乙酸钠	Bioshop	SAA305.500
牛血清白蛋白标准品	bio-rad	500-0206
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Fisher scientific	BP120-500
聚乙二醇 3350	Bioshop	PEG335.1
聚乙二醇 8000	Bioshop	PEG800.1
超声破碎仪	Fisher scientific	FB-120-110
十二烷基硫酸钠	Bioshop	SDS001