重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的分离与纯化

摘要

来源：Jain, R. W., et al. 用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简易高效制备与纯化. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了MOGtag（一种用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）研究的重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG））的分离与纯化过程。该方案包括细菌裂解、超声处理、离心及镍亲和层析，以获得纯化的MOGtag蛋白。该蛋白可用于多发性硬化模型中B细胞介导的自身免疫研究。

方案

1. 收获 MOGtag 蛋白

注意：在此阶段，细菌将产生大量 MOGtag 蛋白。为收获 MOGtag，首先使用 Triton X-100 缓冲液裂解细菌，随后进行超声处理。接着，MOGtag 从包涵体中释放，并用咪唑和胍进行变性，从而获得含有 MOGtag 蛋白的粗提蛋白溶液。

1. 取一例夜间培养物中的1 ml等分试样，转移至1.5 ml微量离心管中。在16,000 × g条件下离心1分钟以沉淀细胞，并弃去上清液。将该管标记为TO/N（诱导后），然后将细菌沉淀置于-20 °C冰箱中，用于后续SDS-PAGE分析（图2）。
2. 将培养物均匀分配至适合高速离心的250 ml瓶中，并从此步骤开始始终将其置于冰上。在4 °C条件下，以22,000 × g离心15分钟，沉淀细菌细胞。
3. 弃去上清液。将细菌沉淀保存于-20 °C，或继续进行步骤1.4。
4. 通过向60 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入60 µl Triton X-100和120 µl浓度为50 mg/ml的鸡卵清溶菌酶储备液，配制裂解缓冲液（含0.1 mg/ml鸡卵清溶菌酶、0.1% Triton-X（v/v）的磷酸盐缓冲液（PBS））。
5. 用总共30 ml裂解缓冲液重悬并合并步骤1.3中获得的所有细菌沉淀。将此液体转移至可承受高速离心的50 ml圆底管中。将该管置于30 °C水浴中孵育30分钟。孵育期间，振荡混匀两次以重新悬浮细胞。
6. 孵育结束后，将管置于冰上，使用20 kHz频率、70%振幅、脉冲开启3秒、关闭3秒、每轮5次脉冲的条件进行超声处理。共进行六轮超声处理，每轮之间将溶液置于冰上冷却。
7. 在4 °C条件下以24,000 × g离心15分钟。弃去上清液，并重复步骤1.5–1.7一次。将沉淀保存于-20 °C，或继续进行步骤1.8。
8. 通过将0.8766 g NaCl（氯化钠）、0.09456 g Tris-HCl（三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐）和0.01021 g咪唑加入100 ml烧杯中，配制缓冲液A（500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mM咪唑，pH 7.9）。加水至体积达28 ml，调节溶液pH至7.9，然后将溶液转移至100 ml量筒中，加水至总体积为30 ml。
9. 用30 ml缓冲液A重悬步骤1.7中获得的沉淀，并在4 °C孵育3小时。在此期间，称取17.2 g盐酸胍（guanidine-HCl）。
10. 在冰上使用与步骤1.6相同的参数对溶液进行超声处理。然后向溶液中加入17.2 g盐酸胍。继续在冰上孵育1小时，以溶解MOGtag蛋白。
11. 在4 °C条件下以24,000 × g离心30分钟。收集上清液，并将上清液在4 °C保存，直至进行蛋白纯化。

2. 蛋白质纯化

注意： 在以下步骤中，将通过4轮在带电荷的镍树脂上吸附（通过His标签）和洗脱来纯化MOGtag蛋白。

1. 配制以下缓冲液：
   1. 配制缓冲液B（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5 mM 咪唑，6 M 盐酸胍，pH 7.9）。将5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl、0.0681 g 咪唑和114.64 g 盐酸胍加入一个500 ml烧杯中，然后加水至190 ml，调节pH至7.9。将溶液转移至250 ml量筒中，加水定容至200 ml。
   2. 配制洗脱缓冲液（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，0.5 M 咪唑，6 M 盐酸胍，pH 7.9）。将5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl、6.808 g 咪唑和114.64 g 盐酸胍加入一个500 ml烧杯中，加水至190 ml，调节pH至7.9。将溶液转移至250 ml量筒中，加水定容至200 ml。
   3. 配制剥离缓冲液（500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，100 mM EDTA（乙二胺四乙酸），pH 7.9）。将5.844 g NaCl、0.6304 g Tris-HCl和40 ml 500 mM EDTA加入一个500 ml烧杯中，加水至190 ml，调节pH至7.9。将溶液转移至250 ml量筒中，加水定容至200 ml。
   4. 配制上样缓冲液（0.1 M 硫酸镍）。将5.257 g 硫酸镍加入一个500 ml烧杯中，加水至190 ml（注意：在通风橱外操作前，必须确保硫酸镍已完全溶于水中）。待硫酸镍完全溶解后，将溶液转移至250 ml量筒中，加水定容至200 ml。
2. 将10 ml 镍树脂均分为两份，分别加入两个可耐受超过4,500 × g离心力的50 ml锥形离心管中（每管5 ml）。
3. 对镍树脂进行上样和平衡：
   1. 向每管树脂中加入40 ml水进行洗涤。将离心管水平放置于摇床上，在4 °C下振荡5分钟。完成后，在4 °C下以4,500 × g离心8分钟。
   2. 用移液器小心弃去上清液，避免扰动沉淀。向每管中加入40 ml上样缓冲液，将离心管置于摇床上，在4 °C下振荡15分钟。完成后，在4 °C下以4,500 × g离心8分钟。
   3. 弃去上清液，然后向每管中加入40 ml缓冲液B。将离心管置于摇床上，在4 °C下振荡5分钟。完成后，在4 °C下以4,500 × g离心8分钟，随后弃去上清液。
4. 可选步骤：取步骤1.11中收集的150 µl溶解蛋白，转移至一个1.5 ml微量离心管中。标记该管为“孵育前样品”，并于-20 °C冷冻保存，用于后续SDS（十二烷基硫酸钠）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（图2，粗提MOGtag）。
5. 纯化MOGtag蛋白：
   1. 将步骤1.11中获得的全部溶解蛋白（约40 ml，减去步骤2.4中取出的小量样品）转移至第一个含有镍树脂的离心管（图1，管1）中，混匀后水平放置于4 °C摇床上孵育1小时。
   2. 在4 °C下以4,500 × g离心8分钟。离心完成后，将上清液转移至第二个含有镍树脂的离心管（图1，管2）中，并按前述步骤孵育。同时，继续对管1执行以下步骤3至6。
   3. 用40 ml洗脱缓冲液重悬管1中的镍树脂，在4 °C下水平摇床上振荡5分钟，然后在4 °C下以4,500 × g离心8分钟。
   4. 将含有洗脱MOGtag蛋白的上清液转移至一个标记为“纯化MOGtag蛋白”的250 ml瓶中，并将该瓶置于4 °C保存。每次洗脱步骤所得上清液均应汇集至该瓶中。
   5. 向镍树脂中加入40 ml剥离缓冲液，在4 °C下水平摇床上振荡5分钟。
   6. 在4 °C下以4,500 × g离心8分钟，弃去上清液，然后按照步骤2.3重新对镍树脂进行上样。
   7. 完成后，按照步骤2.5对第二个离心管继续操作。通过总共四轮（或更多轮）溶解蛋白（来自步骤1.11）在已上样镍树脂上的吸附与洗脱，可回收大部分目标蛋白；如有需要，还可通过额外轮次进一步回收更多蛋白。
6. 完成四轮（或更多轮）吸附与洗脱后，将汇集的纯化蛋白于4 °C过夜保存。镍树脂可用40 ml 20%乙醇溶液在4 °C保存，直至下次使用。

结果

图1：制备高纯度MOGtag蛋白所需步骤的概述。 为获得MOGtag蛋白，首先将表达MOGtag蛋白的细菌培养至高密度，然后按照第1节所述，使用IPTG诱导其表达MOGtag。经过过夜培养后，裂解细菌，并通过一系列离心步骤，提取含有MOG...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21 大肠杆菌 - pet32-MOGtag	Kerfoot 实验室		需要这些细菌来表达 MOGtag 蛋白。甘油菌种可根据要求提供。
LB 培养基（Miller 配方）	Bioshop	LBL407.1
氨苄青霉素	Bio basic	AB0028	将粉末溶于 50% 乙醇 / 50% H₂O 中，配制成 100 mg/ml 溶液，-20 °C 保存。
IPTG	Bioshop	IPT002.5	将粉末溶于 H₂O 中，配制成 1 M 溶液，-20 °C 保存。
鸡卵溶菌酶	Bioshop	LYS702.10	用 H₂O 溶解至 50 mg/ml，-80 °C 保存。
吐温-X100	Sigma	T-8532
磷酸盐缓冲液	Life technologies	20012-027	无需使用市售磷酸盐缓冲液，任何标准实验室自制的磷酸盐缓冲液均可满足要求。
氯化钠	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
咪唑	Bioshop	IMD508.100
盐酸胍	Sigma	G3272	纯度必须高于 98%。
0.5 M EDTA	Bioshop	EDT111.500
硫酸镍(II)	Bioshop	NIC700.500
His bind 树脂	EMD Millipore	69670-3	以 20% 乙醇 / 80% H₂O 保存于 4 °C。
无水乙醇	Commercial Alcohols	P016EAAN	根据需要用水稀释。
冰醋酸	Bioshop	ACE222.1
三水合乙酸钠	Bioshop	SAA305.500
牛血清白蛋白标准品	bio-rad	500-0206
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Fisher scientific	BP120-500
聚乙二醇 3350	Bioshop	PEG335.1
聚乙二醇 8000	Bioshop	PEG800.1
超声破碎仪	Fisher scientific	FB-120-110
十二烷基硫酸钠	Bioshop	SDS001