向大鼠脊髓注射病毒载体以进行逆行神经元示踪

摘要

来源：Keefe, K. M., 等．慢病毒载体直接注射揭示大鼠脊髓中的多条运动通路．J. Vis. Exp．（2019）．

本视频演示了将一种高效逆向转运（HiRet）病毒载体注射到大鼠脊髓中以示踪神经通路的方法。该病毒含有用于突触进入的糖蛋白以及编码荧光蛋白的基因。将针头插入脊髓后，以受控速率给予病毒悬液。在给予足够时间使病毒扩散后，最终撤出针头。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 术前准备

1. 手术前数天准备用于病毒注射的拉制玻璃针，使用专为纳升注射器设计的3.5纳升玻璃毛细管移液器。按照制造商说明，用两步式拉针仪将每根毛细管拉制成双针模板。
2. 使用显微剪刀剪去针头模板尖端多余的玻璃约1-2 mm以修整尖端。在显微镜下利用显微镜校准载玻片测量近似孔径大小，筛选出孔径为30-40的针头 µm 孔径。
3. 针头置于30°，使用微量移液器修尖仪制备出一个30-40的尖端 µm 孔径和 45° 斜角。使用校准滑块上的游标尺验证孔径宽度。通过带有柔性针头附件的注射器向玻璃针内通入水和乙醇，以清除碎屑，并用黑色记号笔在针上等间距做标记。
4. 将针头放入先前用70%乙醇清洗过的带盖培养皿中，并在生物安全柜内的紫外灯下消毒30分钟。
5. 在操作前立即从冷冻保存中取出适量的高效逆行运输（HiRet）慢病毒。
   注意： 合适的体积包括注射所需的量（1 µ每次注射量 × 注射次数）再加上少量额外体积以补偿移液和加样过程中的损耗。不使用时，应将病毒置于冰上运输和保存。
6. 通过将注射器插入微泵中，并将其置于带有游标刻度的显微操作仪内，完成注射器的准备工作。
7. 准备玻璃针时，使用装有柔性针头的注射器小心地装入有色染料（如红色油染料），确保针头内无气泡残留。操作针头时应采用无菌技术，避免触碰针尖。
8. 将玻璃针插入注射器，确保针头正确嵌入垫圈，拧紧注射器帽，并使钢制注射针伸出约 ¾ 玻璃针的长度。病毒可在后续步骤中装入针内。

2. 麻醉与手术部位准备

1. 使用电子天平称量动物体重。记录术前体重，以确定所需麻醉剂的用量，并便于术后体重监测。本方案使用雌性Sprague-Dawley大鼠，体重约为200–250 g。
2. 使用异氟烷吸入或氯胺酮/甲苯噻嗪溶液（k/x）注射对大鼠进行麻醉。此处，氯胺酮以67 mg/kg剂量、甲苯噻嗪以6.7 mg/kg剂量腹腔注射。
3. 通过用力捏压足部确认是否达到适当的麻醉平面。若出现反射性回缩，需等待数分钟后再次检查。
   注意： 同时观察胡须、眼睛和呼吸频率以判断意识状态。如果胡须出现抽动、轻触眼睛时有眨眼反应，或呼吸变得快速而浅表，应等待麻醉深度加深后再继续实验操作。在整个椎板切除术和注射手术过程中，持续监测上述体征。若动物显示麻醉过浅，应追加注射等量的仅含氯胺酮的麻醉剂 ½ 原始的 k/x 剂量
4. 从髋部至肩胛骨下角沿背部中线剃除大鼠的毛发。拉紧动物皮肤以使剃毛更轻松、更精确。
5. 双眼涂抹眼膏。
6. 在剃毛区域涂抹消毒剂以消毒手术部位。第一次清洁时，用无菌纱布浸透5%碘溶液，擦去所有毛发和碎屑。随后用浸有70%乙醇的无菌纱布单向擦拭，确保不重复接触任何区域。采用相同方法，交替使用浸有碘溶液和乙醇的无菌纱布再重复两次。

3. 手术区域与器械准备

1. 打开一包已灭菌的手术器械，包括手术刀、咬骨钳、鼠齿镊、弹簧剪、止血钳、中号弯头镊以及牵开器或加权钩，通过拆开无菌包装以建立无菌区域。
2. 打开一包无菌外科手套，并将手套的无菌包装纸平放在桌面上，用作放置使用后器械的附加无菌区域，以防止污染原始无菌包装。
3. 将一片#10手术刀片放入无菌区域内，用止血钳将刀片固定在刀柄上。将无菌生理盐水、4.0铬肠线缝合线，以及用于控制出血的材料（如电凝器、无菌纱布、无菌棉签（用于肌肉出血）或明胶海绵、骨蜡（用于骨出血））放置在便于取用的位置。
4. 取出动物并将其置于无菌布上，在膀胱下方垫上纱布以收集尿液。用卷起的毛巾垫在腹部下方，以抬高手术区域。如有条件，可在无菌布下方放置手术加热垫，尤其适用于较长时间的手术。
   注意：在存活手术期间，无菌操作至关重要。应准备一瓶70%乙醇喷雾，用于保持戴着手套的手部无菌；若器械无菌状态受损，或在不同动物手术之间，应使用 bead 灭菌器对器械进行灭菌。

4. 暴露椎体并确定椎板切除部位

1. 通过轻压最后一根肋骨处以定位腰椎或L1椎体，从而确定皮肤切口的位置。以此为解剖标志，使用#10外科手术刀做一长度为3-4 cm的皮肤切口，切口末端位于L1椎体稍下方，以暴露皮下肌肉组织。操作时需用手指绷紧皮肤，同时以手术刀片轻轻撑开并施加稳定压力，确保切口整齐清晰。
2. 必要时用镊子和剪刀剪开并摊开浅层脂肪。（根据目标椎骨的不同，肌肉表层可能存在或不存在较大的脂肪垫。）
3. 用手术刀片的平面或手指触摸棘突。通常，中线区域两侧会有一“V”形的白色筋膜作为标志。先做一个小的向头侧切口，以便用鼠齿钳牢固地夹住上方的棘突，然后在尽可能靠近棘突的位置做两个长而深的切口。在切口最深处，可用手术刀片触碰到椎骨的背侧表面。
4. 用拉钩或带重钩牵开侧方肌肉以改善视野。使用解剖刀、弹簧剪或咬骨钳清除突起周围的肌肉，以辨明其头部形态。
   注意请注意，脊髓并未延伸至椎骨全长，因为脊髓组织在发育过程中比骨骼更早停止生长。这意味着目标脊髓节段可能位于命名不同的椎骨下方。
5. 定位胸椎（T11）以及相邻的T12和T13棘突。
   注意： 可在大鼠脊髓图谱以及先前描述小鼠椎体定位标志的研究中找到辅助确定正确椎体节段的方法，小鼠的椎体结构与大鼠极为相似6,33。保留一个头侧的棘突（如T9）不受干扰，以作为中线定位标志。

5. 进行椎板切除术

1. 确定目标区域后，对T11-T13节段椎骨的背侧进行椎板切除。轻柔撑开椎骨以暴露椎间韧带，此处是使用咬骨钳进行首次咬除骨组织的理想位置。将咬骨钳保持在半闭合状态，以增强精细控制能力。
2. 使用咬骨钳小量分次咬除棘突及椎骨背侧部分。注意避免损伤脊髓或扰动硬脊膜。可用鼠齿钳轻微提起组织，帮助将脊髓与椎骨分离，减少触碰脊髓组织的风险。
3. 清除中线附近的骨质，以便观察中线处的血管。保留一个清晰显露脊髓组织且无碎屑遮挡的骨窗。
4. 用镊子轻触脊髓表面。某些动物即使处于较深麻醉状态，也可能出现反射性跳跃。可在脊髓表面直接滴加数滴局部麻醉剂（如利多卡因），以防止注射过程中发生跳跃反应。
5. 通过将固定钳夹紧在椎板切除窗前后方的棘突上，将动物固定于脊柱固定装置中。利用脊柱固定装置抬高动物腹部，以抵消呼吸运动的影响，从而提高注射针头的稳定性，并确保注射深度准确。

6. 加载病毒并定位注射器

1. 用移液器吸取约 5 µL 病毒液，滴加到一块封口膜上，将注射针置于液滴中，使针尖位于液滴内部。
2. 使用微型泵以 20–100 nL/s 的速度回吸最多 4 µL 病毒液。
3. 将控制器设置为注射模式，从针尖释放少量病毒液，以确认针尖未被堵塞。用实验室擦拭纸擦去多余的病毒液。
   注意：可选用带有不锈钢针头的哈密尔顿注射器（Hamilton syringe）替代拉制的玻璃移液管。
4. 调整显微操作仪的位置，使游标刻度清晰可见，并将针头置于脊髓正中线上。
   注意：有时可通过观察脊髓腹侧表面的一条 крупной 血管来确定中线位置。然而，该血管在不同大鼠个体间可能存在差异，应通过与完整的棘突进行比对来确认中线定位。
5. 利用显微操作仪上的游标刻度，将针头向侧方移动 0.8 mm。
6. 将针头缓慢下放至脊髓表面，使其轻压但不穿破硬脊膜。通过快速扭转的动作穿刺硬脊膜，使针头下探至 1.5 mm 深度。

7. 将病毒注射到脊髓中

1. 针头到位后，设置注射器以 400 nL/min 的速率进行注射。通过观察染料前沿的推进情况，确认病毒正在进入脊髓。脊髓组织应无明显渗漏或膨出。若观察到渗漏，可尝试将注射速度降低至 200 nL/min 以缓解。
2. 注射完成后，将针头在脊髓内留置 2–5 分钟（根据注射体积而定），以促进病毒扩散。
3. 缓慢撤出针头，移至下一个注射位点。沿 L1-L4 脊髓组织长度方向，每隔约 1 mm 选择一个位点，共 6 个等距位点，每个位点注射 1 µL 病毒。只要针头功能正常，可重复用于每次注射。

8. 伤口闭合与术后护理

1. 将动物从脊柱固定装置中取出，并移除用于撑开侧肌的牵开器或钩子。在关闭切口前，确保伤口内无任何异物。
2. 使用4.0铬制肠线缝合肌肉。将缝线剪至靠近结处，以减少内部皮肤刺激的可能性。
3. 使用9 mm伤口钉合器闭合皮肤。为促进最佳愈合，在钉合前应对齐皮肤边缘。
4. 将动物置于水对流加热垫上，并持续监测直至其苏醒。
5. 皮下注射5–10 mL无菌生理盐水以补充液体，并注射抗生素（如头孢唑林）以预防感染。当动物能够自主活动后，将其放回原有饲养笼，并给予初始镇痛药物。密切观察大鼠是否出现疼痛或痛苦迹象，并根据本机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的镇痛方案进行处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀片	Roboz	RS-9801-10	与手术刀配合使用。
1 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309659	用于麻醉剂腹腔注射、可能的麻醉加强注射以及抗生素注射。
10 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309604	用于术后向动物体内注射生理盐水。
4.0 铬制羊肠线缝合线	DemeTECH	NN374-16	在缝合时重新结扎肌肉。
48000 微量移液器磨尖仪	World Precision Instruments	32416	用于将拉制的玻璃毛细管尖端磨成有功能的玻璃针。
5% 碘溶液	Purdue Products L.P.	L01020-08	用于手术部位的消毒。
70% 乙醇	N/A	N/A	用于新制备的玻璃针、手术准备期间的动物模型、术中外科医生双手以及其他所有维持无菌环境的小规模操作的消毒。
麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪溶液）	Zoetis	240048	用于在手术期间维持动物处于适当的意识状态。
抗生素（头孢唑林）	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	需皮下注射，以预防术后感染。
bead 消毒器	CellPoint	5-1450	用于加热消毒手术器械。
骨蜡	Fine Science Tools	19009-00	用于骨出血时封闭骨组织。
电凝器	Fine Science Tools	18010-00	用于封闭手术中切断的动脉或静脉，防止大量失血。
电子天平	Okaus	REV.005	用于手术准备期间称量动物体重。
柔性针头连接装置	World Precision Instruments	MF34G-5	用于清洗玻璃针并将红油装入玻璃针中。
明胶海绵（Gelfoam）	Pfizer	H68079	用于骨出血时封闭骨组织。
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	用于拉制玻璃针——应设计适用于纳升级注射器。
毛发剪	Oster	111038-060-000	用于清除手术部位的毛发。
止血钳	Roboz	RS-7231	用于手术中的常规操作。
吸水纸（Kimwipes）	Kimtech	34155	用于手术中的常规操作。
中号尖头弯镊	Roboz	RS-5136	用于手术中的常规操作。
带游标刻度的显微操作仪	Kanetec	N/A	用于手术期间精确定位。
显微剪刀	Roboz	RS-5621	用于剪断新拉制的玻璃毛细管上的细丝。
带光源和游标目镜刻度的显微镜	Leitz Wetzlar	N/A	用于观察和测量拉制玻璃毛细管磨尖后形成的玻璃针。
微量注射泵控制器	World Precision Instruments	62403	用于控制注射速率。
纳升级 2000 泵头注射器	World Precision Instruments	500150	用于以可控方式装载和注射病毒。
拉针仪	Narishige	PC-100	用于加热并拉伸玻璃毛细管以形成玻璃针。
眼膏	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	用于保护动物在手术期间的眼睛。
Parafilm 封口膜	Bemis	PM-996	用于辅助将病毒装入纳米注射器。
PrecisionGlide 针头（25G × 5/8）	Becton, Dickinson and Company	305122	与 1 mL 和 10 mL 注射器配合使用，以便对动物模型进行注射。
鼠齿镊	Roboz	RS-5152	用于夹持棘突。
红油	N/A	N/A	在注射过程中提供可视化前沿，以便观察病毒进入组织的情况。
牵开器	Roboz	RS-6510	用于撑开手术切口。
Rimadyl 片剂	Bio Serv	MP275-050	用于术后镇痛管理。
咬骨钳	Roboz	RS-8300	用于手术期间从脊柱上移除肌肉。
手术刀片手柄	Roboz	RS-9843	用于在手术期间切开动物模型的皮肤和脂肪垫。
剪刀	Roboz	RS-5980	用于手术中的常规操作。
不锈钢伤口夹	CellPoint	201-1000	用于缝合时闭合手术切口的皮肤。
缝合钉拆除钳	Kent Scientific	INS750347	用于拆除缝合钉，以防其安装不当。
无菌布巾	Phenix Research Products	BP-989	为手术提供无菌操作表面。
无菌棉签	Puritan	806-WC	用于在保持无菌条件下吸收手术切口中的血液。
无菌纱布	Covidien	2146	用于在保持无菌条件下清洁手术区域和手术器械。
无菌生理盐水	Baxter Healthcare Corporation	281324	用于清除血液以及术后补液。
外科手套	N/A	N/A	供外科医生使用，以在手术期间维持无菌区域。
手术加热垫	N/A	N/A	用于在手术期间维持动物模型的体温。
手术显微镜	N/A	N/A	用于增强手术切口的可视化效果。
外科缝合器	Kent Scientific	INS750546	用于施加缝合钉。
T/Pump 热疗水泵	Gaymar	TP500C	用于将温水泵入水循环加温垫中。
水循环加温垫	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	用于术后恢复区，以维持无意识动物的体温。
配重钩	N/A	N/A	用于撑开手术切口。