向大鼠脊髓注射病毒载体以进行逆行神经元示踪

摘要

来源：Keefe, K. M., 等．慢病毒载体直接注射揭示大鼠脊髓中的多条运动通路．J. Vis. Exp．（2019）．

本视频演示了将一种高效逆向转运（HiRet）病毒载体注射到大鼠脊髓中以示踪神经通路的方法。该病毒含有用于突触进入的糖蛋白以及编码荧光蛋白的基因。将针头插入脊髓后，以受控速率给予病毒悬液。在给予足够时间使病毒扩散后，最终撤出针头。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 术前准备

1. 手术前数天准备用于病毒注射的拉制玻璃针，使用专为纳升注射器设计的3.5纳升玻璃毛细管移液器。按照制造商说明，用两步式拉针仪将每根毛细管拉制成双针模板。
2. 使用显微剪刀剪去针头模板尖端多余的玻璃约1-2 mm以修整尖端。在显微镜下利用显微镜校准载玻片测量近似孔径大小，筛选出孔径为30-40的针头 µm 孔径。
3. 针头置于30°，使用微量移液器修尖仪制备出一个30-40的尖端 µm 孔径和 45° 斜角。使用校准滑块上的游标尺验证孔径宽度。通过带有柔性针头附件的注射器向玻璃针内通入水和乙醇，以清除碎屑，并用黑色记号笔在针上等间距做标记。
4. 将针头放入先前用70%乙醇清洗过的带盖培养皿中，并在生物安全柜内的紫外灯下消毒30分钟。
5. 在操作前立即从冷冻保存中取出适量的高效逆行运输（HiRet）慢病毒。
   注意： 合适的体积包括注射所需的量（1 µ每次注射量 × 注射次数）再加上少量额外体积以补偿移液和加样过程中的损耗。不使用时，应将病毒置于冰上运输和保存。
6. 通过将注射器插入微泵中，并将其置于带有游标刻度的显微操作仪内，完成注射器的准备工作。
7. 准备玻璃针时，使用装有柔性针头的注射器小心地装入有色染料（如红色油染料），确保针头内无气泡残....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀片	Roboz	RS-9801-10	与手术刀配合使用。
1 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309659	用于麻醉剂腹腔注射、可能的麻醉加强注射以及抗生素注射。
10 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309604	用于术后向动物体内注射生理盐水。
4.0 铬制羊肠线缝合线	DemeTECH	NN374-16	在缝合时重新结扎肌肉。
48000 微量移液器磨尖仪	World Precision Instruments	32416	用于将拉制的玻璃毛细管尖端磨成有功能的玻璃针。
5% 碘溶液	Purdue Products L.P.	L01020-08	用于手术部位的消毒。
70% 乙醇	N/A	N/A	用于新制备的玻璃针、手术准备期间的动物模型、术中外科医生双手以及其他所有维持无菌环境的小规模操作的消毒。
麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪溶液）	Zoetis	240048	用于在手术期间维持动物处于适当的意识状态。
抗生素（头孢唑林）	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	需皮下注射，以预防术后感染。
bead 消毒器	CellPoint	5-1450	用于加热消毒手术器械。
骨蜡	Fine Science Tools	19009-00	用于骨出血时封闭骨组织。
电凝器	Fine Science Tools	18010-00	用于封闭手术中切断的动脉或静脉，防止大量失血。
电子天平	Okaus	REV.005	用于手术准备期间称量动物体重。
柔性针头连接装置	World Precision Instruments	MF34G-5	用于清洗玻璃针并将红油装入玻璃针中。
明胶海绵（Gelfoam）	Pfizer	H68079	用于骨出血时封闭骨组织。
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	用于拉制玻璃针——应设计适用于纳升级注射器。
毛发剪	Oster	111038-060-000	用于清除手术部位的毛发。
止血钳	Roboz	RS-7231	用于手术中的常规操作。
吸水纸（Kimwipes）	Kimtech	34155	用于手术中的常规操作。
中号尖头弯镊	Roboz	RS-5136	用于手术中的常规操作。
带游标刻度的显微操作仪	Kanetec	N/A	用于手术期间精确定位。
显微剪刀	Roboz	RS-5621	用于剪断新拉制的玻璃毛细管上的细丝。
带光源和游标目镜刻度的显微镜	Leitz Wetzlar	N/A	用于观察和测量拉制玻璃毛细管磨尖后形成的玻璃针。
微量注射泵控制器	World Precision Instruments	62403	用于控制注射速率。
纳升级 2000 泵头注射器	World Precision Instruments	500150	用于以可控方式装载和注射病毒。
拉针仪	Narishige	PC-100	用于加热并拉伸玻璃毛细管以形成玻璃针。
眼膏	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	用于保护动物在手术期间的眼睛。
Parafilm 封口膜	Bemis	PM-996	用于辅助将病毒装入纳米注射器。
PrecisionGlide 针头（25G × 5/8）	Becton, Dickinson and Company	305122	与 1 mL 和 10 mL 注射器配合使用，以便对动物模型进行注射。
鼠齿镊	Roboz	RS-5152	用于夹持棘突。
红油	N/A	N/A	在注射过程中提供可视化前沿，以便观察病毒进入组织的情况。
牵开器	Roboz	RS-6510	用于撑开手术切口。
Rimadyl 片剂	Bio Serv	MP275-050	用于术后镇痛管理。
咬骨钳	Roboz	RS-8300	用于手术期间从脊柱上移除肌肉。
手术刀片手柄	Roboz	RS-9843	用于在手术期间切开动物模型的皮肤和脂肪垫。
剪刀	Roboz	RS-5980	用于手术中的常规操作。
不锈钢伤口夹	CellPoint	201-1000	用于缝合时闭合手术切口的皮肤。
缝合钉拆除钳	Kent Scientific	INS750347	用于拆除缝合钉，以防其安装不当。
无菌布巾	Phenix Research Products	BP-989	为手术提供无菌操作表面。
无菌棉签	Puritan	806-WC	用于在保持无菌条件下吸收手术切口中的血液。
无菌纱布	Covidien	2146	用于在保持无菌条件下清洁手术区域和手术器械。
无菌生理盐水	Baxter Healthcare Corporation	281324	用于清除血液以及术后补液。
外科手套	N/A	N/A	供外科医生使用，以在手术期间维持无菌区域。
手术加热垫	N/A	N/A	用于在手术期间维持动物模型的体温。
手术显微镜	N/A	N/A	用于增强手术切口的可视化效果。
外科缝合器	Kent Scientific	INS750546	用于施加缝合钉。
T/Pump 热疗水泵	Gaymar	TP500C	用于将温水泵入水循环加温垫中。
水循环加温垫	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	用于术后恢复区，以维持无意识动物的体温。
配重钩	N/A	N/A	用于撑开手术切口。