高强度聚焦超声在糖尿病大鼠模型中阻断神经动作电位的研究

摘要

来源：Lee, Y. F., 等．用于糖尿病大鼠模型中神经传导阻滞的超声工具．J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了在糖尿病大鼠模型中，利用高强度聚焦超声（HIFU）阻断坐骨神经向腓肠肌传递动作电位的方法。当HIFU声束作用于神经后，肌肉信号的减弱证实了HIFU作为一种非侵入性治疗手段，在缓解糖尿病神经性疼痛方面具有潜在应用价值。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 体内神经传导阻滞的高强度聚焦超声（HIFU）换能器应用

注意： 的 体内 实验于注射50 mg/kg链脲佐菌素（STZ）后的第5周开始。

1. 在使用高强度聚焦超声（HIFU）照射阻断复合肌肉动作电位（CMAPs）之前，先完成动物实验操作。
   1. 手术前将手术器械（手术刀、剪刀、镊子和玻璃钩）在高压灭菌器中灭菌。
   2. 使用氯胺酮/唑拉西泮混合物（40 mg/kg）腹腔注射或通过异氟烷蒸发器吸入1.75%异氟烷对大鼠进行麻醉。将大鼠置于加热垫上以维持其体温。
   3. 将大鼠置于俯卧位以进行手术。涂抹眼膏。伸展大鼠后肢，用指甲轻捏足底皮肤以评估麻醉深度。若大鼠出现回缩反应，应追加麻醉药物。
   4. 用电推剪去除大鼠大腿和下背部的毛发。用洁净纱布蘸取碘液，在手术部位以同心圆方式由内向外擦拭。使用酒精棉片以相同的环形动作擦拭碘液。本实验在左右两侧手术部位进行。进行下一步操作时，需在另一侧手术部位重复上述步骤。
   5. 使用无菌手术剪或手术刀在大腿背侧皮肤做切口。用钝头手术剪仔细分离皮下组织，并用皮肤拉钩固定皮肤。股骨可见于肌肉内部。
   6. 使用剪刀小心地沿股骨方向分离肌肉，直至暴露出埋藏于肌肉中的大腿中部坐骨神经纤维。再用玻璃钩小心地将大腿中部的坐骨神经从周围结缔组织和肌肉中分离出来。
2. 使用定制的神经固定器将坐骨神经置于HIFU焦点区域图1 和 图2).
   注意： 定制的神经固定器由3个部件组成（图2）。所有组件均由透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。组件I顶部结构的外螺纹高度为2.5 mm，规格为M10XP0.7（图3A）。中心孔是一个贯穿组件I的直径为4.0 mm的孔。孔的底部开口由一片胶带密封。槽的直径为1.2 mm，槽的中心平面与组件I顶面之间的距离为3.1 mm。组件II由主体、四条支腿和底部结构组成（图3B）。底部结构的内螺纹高度为2.5 mm，规格为M10XP0.7，用于与部件I的外螺纹配合。中心孔的直径与部件I的中心孔相同。主体部分直径为32 mm，厚度为5.4 mm。四个支脚呈对称分布，其中两个相同的短支脚用于对准定位，两个相同的长支脚用于钩挂部件III。部件III的外径和高度分别为41 mm和9.2 mm。其内螺纹规格为M36XP1.0，通孔直径为27.5 mm。图 3C）。圆锥是一个中空的锥形结构，顶部开口直径为84 mm，底部开口直径为27.5 mm，高度为57.5 mm（图 4A).
   1. 实验前，将定制的丙烯酸神经固定器浸泡于漂白剂溶液中 30 - 60 分钟，随后浸泡于无菌水中。
   2. 用玻璃钩小心提起神经，将其放入组件 I 的槽中。
   3. 将组件II拧入组件I。在组件I的中央孔中加入用于超声传播和神经保存的林格氏溶液。
   4. 将组件III旋入HIFU外壳锥部。通过组件II的四条支腿将组件III与组件II对接。
      注意： 三个组件与换能器的几何中心对齐。神经与换能器之间的距离等于焦距，从而确保神经位于高强度聚焦超声（HIFU）的焦点区域内。
3. 将一对针灸针插入坐骨神经起始处，另一对针插入腓肠肌。通过同轴电缆将每对针连接至电生理采集系统图1).
   注意： 电缆一端有两个鳄鱼夹，用于分别夹住两根针，另一端为卡口式尼尔-康塞曼（BNC）连接器，用于连接系统。成对的 acupuncture 针在坐骨神经处作为刺激电极，在腓肠肌处作为记录电极。
   1. 将电生理记录系统的采样率和带宽分别设置为 50 kHz 和 70 Hz–3 kHz。在坐骨神经起始处的刺激电极上施加脉宽为 0.1 ms 的超最大刺激。
   2. 使用电生理采集系统中的内置放大器记录记录电极的CMAP，并对CMAP进行放大。
      注意： 使用电生理信号采集系统内置的放大器放大神经信号，并通过该系统记录来自记录电极的复合肌肉动作电位（CMAPs）。
4. 使用商用2.68 MHz HIFU换能器抑制糖尿病神经病变大鼠的复合肌肉动作电位（CMAPs）。
   注意： 换能器的规格描述如下：单元件球形碗，孔径直径为6 cm，焦距为5 cm，在自由场中形成椭球形焦区，深度为4 mm，宽度为0.8 mm。
   1. 将球形锥体、HIFU换能器和锥体盖浸入装有脱气水的水槽中。将HIFU换能器放入球形锥体内，并用六颗头螺钉将锥体盖固定在球形锥体的顶部开口处图4B）。由于气泡的密度低于水，可让球形锥体中的气泡自然排出，然后用厚度为0.03 mm的透明胶带密封锥体前端开口。将组件III旋紧到球形锥体上。
   2. 从脱气水箱中取出带有球形圆锥和组件III的HIFU换能器。
      注意： 反渗透（RO）水是通过反渗透工艺纯化得到的水。将RO水煮沸以去除气体，冷却后在独立的密闭容器中获得脱气水。
5. 将组件I小心地置于神经与肌肉之间的空隙中，并将神经置于组件I的间隙内。执行步骤1.2.3和1.2.4，以确保神经位于HIFU的聚焦区域内。图2A).
6. 连接函数发生器与射频功率放大器。将功率放大器连接至HIFU换能器，以产生HIFU声束。手动设置函数发生器输出至HIFU换能器的电压 通过 功率放大器。高强度聚焦超声照射时间结束后，手动关闭信号发生器。使用计时器观察时间。
   注意： 本研究中使用的HIFU束的强度和能量为2,810 W/cm² 和 84 J/mm²分别。
7. 同时通过电生理采集系统（步骤1.3）和HIFU系统（步骤1.6）向坐骨神经施加刺激，并记录复合肌肉动作电位（CMAPs）。逐步增加HIFU对坐骨神经的照射时间，从3秒、5秒增至8秒，直至观察到CMAPs波幅下降或受到抑制。
   1. 以每秒一次的频率记录HIFU声束照射期间的复合肌肉动作电位（CMAPs）。观察到CMAPs波幅变化后，关闭HIFU系统，并手动点击电生理采集软件上的记录图标，在最初的10分钟内每2分钟记录一次CMAPs，随后的30分钟内每5分钟记录一次，最后阶段每10分钟记录一次，直至总记录时间达到2小时。
8. 分离神经固定器的II部分和III部分（图2) 将HIFU换能器从切口处移除。分离组件II和I，以释放固定的坐骨神经。记录CMAPs后，使用4-0铬制肠线缝合糖尿病大鼠的手术部位。在手术部位涂抹液态碘以预防感染。
   1. 将笼子放在加热垫上，让大鼠在返回动物房之前于笼中恢复。给予大鼠饮用水中含布洛芬治疗3天，或腹腔注射丁丙诺啡（0.05 - 0.1 mg/kg）。
9. 在初次HIFU超声处理后的第7、14和28天，按照步骤1.1.2和1.3所述，将刺激和记录电极插入麻醉的糖尿病神经病变大鼠坐骨神经起始处和腓肠肌中。

结果

图1：利用高强度聚焦超声（HIFU）进行体内神经传导阻滞的实验装置。（A）一个定制的丙烯酸球形锥体，内部充满反渗透脱气水，与神经固定器结合，确保HIFU换能器的焦区位于神经的焦平面上。（B）图中显示了刺激电极和记录电极。神经固定器将坐骨神经置于HIFU声束的焦平面内。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
链脲佐菌素	Sigma	85882
Biopac MP36 数据采集系统	Biopac Systems, Inc.
HIFU 换能器	Sonic Concepts	H108
函数发生器	Agilent	33250A
功率放大器	Electronics & Innovation	1040L
大鼠	Biolasco 中国台湾	Sprague-Dawley
Puralube vet 软膏	Dechra
异氟烷蒸发器	Parkland Scientific	V3000PS
异氟烷	Attane