将中间神经元前体细胞移植到小鼠幼崽脑内

摘要

来源：Quattrocolo, G., et al. 将中间神经元前体细胞同源移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了使用同位或异位方法将中间神经元前体细胞移植到新生小鼠大脑中的操作。该过程包括固定麻醉后的受体幼鼠，确定目标脑区，并注射来自同发育阶段供体幼鼠的前体细胞悬液。注射后，将幼鼠转移至加热垫上恢复，以便后续评估供体细胞的存活与成熟情况。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. P0-P2 小鼠脑组织的取出

1. 在开始操作前，将数个培养皿中装入冰冷的、充氧的蔗糖人工脑脊液（sACSF）。同时，在收集管中加入约 25 mL sACSF。
2. 用保鲜膜或手套包裹出生后第 0 至 2 天（P0-P2）的幼鼠，并将其完全覆盖后置于冰上。设置计时器为 5 分钟并开始计时。计时结束后取出幼鼠，检查其对后肢足垫夹捏无反应。
3. 将幼鼠断头，把头部放入盛有 sACSF 的培养皿中。沿中线切开皮肤以暴露颅骨。
4. 找到位于后脑/脊髓交界处颅骨上的开口，将镊子一端沿颅骨背侧插入。轻轻夹住颅骨中线部位，向两侧“剥离”颅骨碎片以暴露脑组织，注意避免损伤脑组织。
5. 去除颅骨的背侧和侧部后，使用镊子或刮匙从脑腹面下方轻轻托起，将脑组织完整取出，尽量避免任何区域受损。将脑组织放入另一个盛有充氧 sACSF 的培养皿中。注意：本文提供了两种不同的方法用于分离海马、纹状体和皮层。第一种方法（步骤 2.1–2.10）适用于任何小鼠品系；而第二种方法（步骤 3.1–3.7）需要使用荧光报告小鼠，以便清晰区分纹状体与苍白球及其他脑区结构。若无需获取纹状体，则可忽略两种方法中针对纹状体的操作部分。

2. 分离纹状体、海马和皮层，技术 #1

1. 将整个脑组织置于切片模具中，腹面朝上。将一把刀片穿过脑组织最前部（穿过前嗅束）。
2. 在第一把刀片稍后方插入另一把刀片，以制备厚度为 0.5 mm 的脑片，并在该刀片后方再放置一把刀片。
3. 将这些脑片转移至含有通氧 sACSF 的培养皿中，将剩余脑组织放入另一含有 sACSF 的培养皿中。将纹状体脑片转移至解剖显微镜下以观察纹状体。这些脑片应包含大部分前纹状体区域，并不包含海马体。使用荧光解剖显微镜观察 Nkx2.1-Cre^+/-;Ai9^+/- 脑片，以区分纹状体中微弱的 tdTomato 信号与苍白球中强烈的 tdTomato 信号。
4. 无论是否使用荧光，从所有切片的双侧半球中夹取纹状体组织，并将纹状体组织块转移至标记妥当的 50 mL 离心管中，管内含 sACSF，置于冰上保存。
5. 使用镊子或刀片沿中线将脑组织纵向切开，将半脑组织放置，使内侧面向上。
6. 用镊子夹除腹侧脑组织（丘脑、基底神经节等）。操作完成后，应清晰可见海马体（一个沿背侧皮层前后轴延伸的香肠状结构）以及皮层的脑室面。
7. 为分离海马体，将镊子尖端插入前部海马体前方，然后向后移动镊子，沿海马体-皮层边界轻轻分离并夹取海马体。将分离出的海马体转移至标记妥当的 50 mL 离心管中，管内含 sACSF，置于冰上保存。
8. 为分离皮层，将半切后的皮层内侧面朝下放置。然后使用镊子夹取皮层最背侧、腹侧、前侧和后侧部分，保留一块约 2 mm × 2 mm 的内侧体感皮层组织块。将皮层翻转，使内侧面朝上，必要时用镊子清除内侧面上残留的非皮层组织（如丘脑、基底神经节等）。将皮层组织块转移至标记妥当的 50 mL 离心管中，管内含 sACSF，置于冰上保存。
9. 对另一侧半球重复上述操作，以收集双侧海马体和皮层组织。
10. 对所有幼鼠重复此操作，每次更换幼鼠之间需更换培养皿中的 sACSF，以确保 sACSF 始终保持低温且新鲜。

3. 分离纹状体、海马和皮层，技术 #2

1. 将脑腹侧朝下置于含有sACSF的硅胶包被培养皿中，并通过小脑和前皮质或嗅球固定。
2. 从一侧半球开始，使用弯头镊子轻轻分离后皮质与下方的海马及其他组织。将剥离的皮质平整地铺在培养皿中。对另一侧半球重复此操作。暴露的脑组织中，海马和纹状体应清晰可见。
3. 用镊子在中线处夹住一侧海马，向侧方轻轻剥离以移除。将其放入冰上的收集管中，并对另一侧海马重复操作。
4. 对于纹状体，先用镊子轻轻刮除其周围边缘组织以松解与周围组织的连接，然后从下方夹取并移除纹状体，放入冰上的收集管中。对另一侧纹状体重复此步骤。
5. 皮质组织可按照第2.8步所述方法进行采集。
6. 若使用转基因报告小鼠品系（例如 Nkx2.1-Cre;Ai9、Lhx6-GFP 等），将纹状体转移至含sACSF的培养皿中，在荧光解剖显微镜下观察。用镊子去除纹状体中混杂的非纹状体组织（在 Nkx2.1-Cre;Ai9 小鼠中，需去除所有“明亮”组织，因为苍白球的内侧神经节隆起来源tdTomato+细胞密度显著高于纹状体）。对所有纹状体重复此操作。
7. 对所有仔鼠重复上述操作，每次更换培养皿中的sACSF，以确保sACSF保持低温且新鲜。

4. 单细胞解离的制备

1. 解剖完成后，称取10 mg Pronase，溶于10 mL通入碳酰气的sACSF中，配制1 mg/mL的Pronase溶液。
2. 将组织从50 mL收集瓶转移至含有2 mL Pronase-sACSF溶液的5 mL圆底管中。在室温下孵育组织20分钟，孵育期间用手指轻摇或轻弹管壁3–4次以混匀样品。
3. 孵育期间，配制重悬液：在10 mL通入碳酰气体的sACSF中加入1%胎牛血清（FBS，100 μL）和DNA酶（1 μL 1:10,000浓度的DNA酶储备液）。
4. 20 分钟后，小心移除蛋白酶溶液，避免扰动底部的组织，然后加入 1–2 mL 重构溶液（总体积取决于起始组织量）。
5. 使用预先制备的火焰抛光巴斯德吸管通过吹打对组织进行机械解离。首先使用大孔径（约600 µm）吸管，将组织悬液反复吹打至少十次，以充分分散组织。操作过程中避免产生气泡。随后依次使用中等孔径和小孔径吸管重复此吹打过程。最终悬液应呈浑浊状，收集管中不应有可见的清晰组织块。
6. 将细胞裂解液通过50 µm滤膜转移至5 mL锥形管中，以去除细胞团块。将所得单细胞悬液用于流式细胞术分析（若无需分选，可直接进行细胞计数）。

5. 准备用于移植的荧光激活细胞分选（FACS）纯化细胞悬液

1. 从流式细胞仪接收到细胞悬液后，将溶液转移至一个（或多个）1.5 mL离心管中，在4^oC条件下以500 g离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，保留约20–40 µL液体于管中。利用剩余液体重悬细胞（若使用多个离心管，需合并所有溶液）。
2. 取一小片封口膜，将2 µL细胞悬液、8 µL sACSF和10 µL台盼蓝染液混合均匀。用移液器吸取10 µL混合液，加入血细胞计数板，并盖上盖玻片。
3. 使用标准实验室手动计数器，在血细胞计数板四个角的4×4方格区域内分别计数活细胞数量（死细胞因染料作用呈蓝色），取四个区域计数的平均值。将该平均值乘以100，得到每微升（µL）的细胞数量。
4. 如有需要，调整体积使细胞在重悬液中的浓度达到10,000–30,000个细胞/µL。最终浓度应根据细胞总量及所需移植次数确定。细胞置于冰上保存，用于后续移植操作。

6. 移植至 P0-2 野生型幼鼠

1. 将野生型（WT）幼鼠用石蜡膜或手套包裹，完全覆盖后置于冰上。设置5分钟计时器并开始计时。计时结束后取出幼鼠，检查其对后肢足垫捏压无反应。
2. 在将幼崽置于冰上时，用移液器反复吹打细胞溶液数次，以确保在加样前细胞悬液充分混匀（每次注射前，均需在加样前混匀细胞）。随后，将微量移液器中的石蜡油排空，并完全填充细胞悬液。
3. 将麻醉后的小鼠置于培养皿中，使其头部置于黏性橡皮泥上，确保头顶部相对平坦。将带有菱形孔的胶带贴于小鼠头部，拉紧胶带，以保证皮肤伸展、头部固定，同时确保小鼠舒适且呼吸顺畅。菱形孔下应能清晰看到人字缝（lambda）。
4. 将固定好的幼鼠移至Nanoject下方，降低微量移液管，使移液管尖端位于λ点正上方。记录操纵器上的x-y坐标。
5. 调节操作仪旋钮，将微移液管沿头部的内外侧方向和前后方向移动至目标坐标：初级躯体感觉皮层（S1皮层）→ 前向1.0 mm，外侧1.0 mm；海马 → 前向0.75–1.0 mm，外侧1.0–1.2 mm；纹状体 → 前向2.0–2.2 mm，外侧1.5 mm。可根据幼鼠年龄（如P0与P2）或小鼠品系（如P2时CD1小鼠比C57/B6更大）对坐标进行微调。
6. 将微量移液器缓慢下降，直至其在皮肤表面形成微小凹陷。然后牢固而轻柔地转动Z轴操纵杆旋钮，使微量移液器穿过皮肤和颅骨进入脑组织。当微量移液器进入脑部时，颅骨上的压力会释放，凹陷随之消失。
7. 轻微回撤微量移液器，直至其尖端被一个呈帐篷状的皮肤锥体所包围。读取 z 轴坐标：此即为 z 轴的零点。
8. 将微量移液器降至所需深度：大脑皮层 → 0.75–1.0 mm，海马 → 1.2–1.5 mm，纹状体 → 2.0–2.5 mm。可根据幼鼠的年龄或品系略微调整深度。
9. 使用上述 Nanoject III 程序注入细胞悬液。注射程序完成后，等待 15–20 秒，再缓慢撤出微量移液管，以尽量减少注射部位的溶液渗漏。
10. 若进行双侧注射，需在λ点上方重新归零微量移液器，然后移动至对侧半球的相应坐标位置。或者，也可将微量移液器移至首次注射点前方1 mm处，在同侧半球的皮层进行第二次注射。
11. 移植完成后，取下胶带，将仔鼠转移至加热垫上。如有必要，可通过尾部或脚趾剪切法对仔鼠进行标记。待仔鼠恢复红色体色并开始活动后，将其放回母鼠所在的鼠笼中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑部定位矩阵	Roboz	SA-2165	仅在分离纹状体时需要
精细尖头杜蒙镊	Roboz	RS-4978
显微解剖剪刀	Roboz	RS-5940
刀片	ThermoFisher	12-640
巴斯德吸管	ThermoFisher	1367820C
Nanoject III 注射仪	Drummond	3-000-207
带支架的手动操作器	World Precision Instruments	M3301R/M10
5 ml 圆底塑料离心管	ThermoFisher	149591A
60 mm 培养皿	ThermoFisher	12556001
100 mm 培养皿	ThermoFisher	12565100
蛋白酶 K（Pronase）	Sigma	10165921001
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher	16140063
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma	4716728001
Celltrics 50µm 滤膜	Sysmex	04-0042327
台盼蓝	ThermoFisher	15-250-061
血细胞计数板	ThermoFisher	02-671-6