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所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。
1. 去除 P0-P2 小鼠大脑
- 在开始手术之前，用冷冻的碳氧合蔗糖人工脑脊液 （sACSF） 填充几个培养皿。还用 ~25 mL sACSF 填充收集管。
用- 一些封口膜或手套包裹出生后 0 至 2 天 （P0-P2） 的幼犬，并将其盖在冰下。设置一个 5 分钟的计时器并启动它。之后，将幼犬移开并检查它是否对捏后爪没有反应。
- 将幼崽斩首并将头部收集在装满 sACSF 的培养皿中。沿中线切开皮肤以暴露头骨。
- 找到后脑/脊髓头骨的开口，然后沿着颅骨的背侧插入镊子的一端。轻轻抓住头骨的中线，横向"剥离"碎片以露出大脑，注意不要损伤大脑。
切除- 颅骨的背侧和侧面后，使用镊子或抹刀从大脑腹侧表面下方舀取，轻轻地将大脑从颅骨中取出，尽量不要损坏任何区域。将大脑放入另一个装满碳氧合sACSF的培养皿中。注意：我们提出了两种不同的策略来解剖海马体、纹状体和皮层。第一种策略（步骤2.1-2.10）对任何小鼠系都很有用，而第二种策略（步骤3.1-3.7）需要荧光报告小鼠将纹状体与苍白球和其他大脑结构干净地分离。如果不需要纹状体，则忽略两种技术的纹状体特异性部分
2。收获纹状体、海马体和皮层，技术 #1
将
- 整个大脑放在切片基质模具上，腹侧朝上。将 1 个剃须刀片穿过大脑的最前部（通过前嗅道）。
在- 第一个剃须刀片的后面插入另一个剃须刀片以生成一个 0.5 毫米的切片，并在该刀片的后面放置一个额外的剃须刀片。
- 将这些切片转移到含有碳水化合物化 sACSF 的培养皿中，并将大脑的其余部分放入含有 sACSF 的单独培养皿中。将纹状体切片转移到解剖镜中以观察纹状体。这些切片应包含大部分前纹状体并且缺乏海马体。使用带有 Nkx2.1-Cre+/- 的荧光解剖镜;Ai9+/- 切片，以区分苍白球的弱纹状体 tdTomato 信号和强 tdTomato 信号。
- 有或没有荧光，从所有切片的两个半球捏出纹状体，并将纹状体块转移到正确标记的带有sACSF的50mL管中，储存在冰上。
- 使用镊子或剃须刀片沿中线将大脑半剖开，然后放置半球，使内侧表面朝上。
用镊子捏- 掉腹侧脑组织（丘脑、基底神经节等），去除腹侧脑组织。完成后，海马体（沿背侧皮层横跨前后轴的香肠状结构）和皮层的心室侧应该清晰可见。
- 要去除海马体，请将镊子的尖端插入前海马体前面，并通过向后移动镊子并沿着海马皮质边界捏住，轻轻地将海马体与皮质分开。将分离的海马体转移到带有 sACSF 的正确标记的 50 mL 管中，储存在冰上。
- 要解剖皮层，请将半切除的皮层内侧朝下。然后用镊子捏住皮层的最背侧、腹侧、前部和后部，留下一块方形的内侧体感皮层，~2 毫米 x 2 毫米。如有必要，翻转皮层，使内侧朝上，并清除内侧表面上任何多余的非皮质组织（丘脑、基底神经节等）。将皮质块转移到带有 sACSF 的正确标记的 50 mL 管中，储存在冰上。
- 对另一个半球重复该过程以收集海马体和皮层区域。
- 对所有幼崽重复此过程，确保在幼崽之间更换培养皿中的 sACSF，以确保 sACSF 保持冷和新鲜。
3. 收获纹状体、海马体和皮层，技术 #2
- 将大脑腹侧朝下放入含有 sACSF 的 sylgard 涂层培养皿中，并通过小脑和前皮层或嗅球将其固定下来。
从- 一个半球开始，使用弯曲的镊子轻轻地将后皮层与下面的海马体和其他组织分开。轻轻地将去皮的皮层平放在培养皿上。对另一个半球重复上述步骤。海马体和纹状体在暴露的大脑中应清晰可见。
- 用镊子捏住中线处的一只海马体，横向剥离海马体以去除。放入冰上的收集瓶中，并与其他海马体重复。
- 对于纹状体，轻轻刮擦纹状体的边缘，使其从周围组织中松开。然后，从下面捏下纹状体并将其添加到冰上的收集管中，将其取出。对另一个纹状体重复上述步骤。
- 可以按照步骤2.8中的描述收获皮质切片。
- 如果使用转基因报告小鼠系（例如，Nkx2.1-Cre;Ai9、Lhx6-GFP等），将纹状体转移到含有sACSF的培养皿中，并在荧光解剖镜下观察。使用镊子从纹状体中去除任何非纹状体组织（在 Nkx2.1-Cre 中;Ai9小鼠，去除所有"明亮"组织，因为苍白球与纹状体相比，具有更高的内侧神经节隆起或MGE衍生的tdTomato+细胞密度）。对所有纹状体重复此作。
- 对所有幼崽重复此过程，确保在幼崽之间更换培养皿中的 sACSF，以确保 sACSF 保持冷和新鲜。
4. 产生单细胞解离解剖
- 完成后，称取 10 mg 前列腺酶并溶解在 10 mL 碳氧合 sACSF 中，制备 1 mg/mL 前列腺酶溶液。
- 将组织从 50 mL 收集瓶转移到含有 2 mL Pronase-sACSF 溶液的 5 mL 圆底管中。在室温下孵育组织 20 分钟，在孵育过程中用手指摇动/轻弹试管 3-4 次以混合样品。
在此- 孵育期间，制备复溶溶液：1% 胎牛血清（FBS，100 μL）+ DNAse（1 μL 1：10,000 储备 DNAse）在 10 mL 碳氧合 sACSF 中。
- 20分钟后，小心地取出前列腺酶溶液，以免干扰底部的组织，并用1-2mL的复溶溶液代替（总体积取决于组织的起始量）。
- 通过用预先制备的火抛光巴斯德移液器研磨组织来机械解离组织。从大口径（~600μm）移液器开始，吸出并排出组织溶液至少十次以分解组织。不要将气泡引入溶液中。对中口径移液器和小口径移液器重复此过程。溶液应浑浊，收集管中不应可见透明组织。
通过 - 50 μm 过滤器将细胞裂解物溶液移液到 5 mL 锥形管中以去除任何细胞团块。继续使用这些单细胞溶液进行流式细胞术（如果不需要分选，则可能直接进行细胞计数）。
5. 制备用于移植的荧光激活细胞分选 （FACS） 纯化的细胞溶液
- 从流式细胞仪接收细胞溶液后，将溶液转移到一个（或多个）1.5 mL 锥形管中，并在 4°C 下以 500 g 旋转细胞 5 分钟。离心后，除去培养基，使 ~20-40 μL 留在管中。在剩余的培养基中复溶细胞（如果需要多个试管，则合并溶液）。
- 在一小块封口膜上，将 2 μL 细胞溶液 + 8 μL sACSF + 10 μL 台盼蓝染色剂混合在一起。将 10 μL 移液到带载玻片盖的血细胞计数器中。
- 使用标准实验室手动计数器（死细胞从染料中呈蓝色）计算血细胞计数器角落中每个 4 x 4 方形网格中的活细胞数量，并平均这 4 个计数。将此数字乘以 100 以确定每 μL 的细胞数。
- 如果需要，调整体积，使细胞在复溶溶液中的浓度为 10,000-30,000 个细胞/μL。最终浓度取决于细胞总量和所需的移植次数。将细胞放在冰上进行移植
6.移植到 P0-2 WT 幼崽中
将
- 野生型 （WT） 幼崽包裹在一些封口膜或手套中，并将其覆盖在冰下。将计时器设置为 5 分钟并启动它。之后，将幼犬移开并检查它是否对捏后爪没有反应。
- 当幼崽在冰上时，通过移液数次来混合细胞溶液，以确保细胞悬液在加载前充分混合（每次注射在加载微量移液器之前混合细胞）。然后清空微量移液器中的矿物油，并用细胞悬液完全填充。
将- 麻醉的小狗放在培养皿上，头躺在粘性腻子上，使头顶相对平坦。将带有菱形孔的胶带放在幼犬的头部，将其拉紧，以确保皮肤被拉伸，头部紧致，但鼠标舒适且呼吸良好。通过金刚石孔应该可以看到 Lambda。
将- 固定的小狗移动到 Nanoject 下方并降低微量移液器，使微量移液器的尖端位于 lambda 的正上方。在纵器上记录 x-y 坐标。
- 调整纵器旋钮，将微量移液器沿头部的中外侧和前后轴移动到所需的坐标：初级体感皮层或 S1 皮层→前 1.0 毫米和外侧 1.0 毫米，海马体→前 0.75-1.0 毫米，外侧 1.0-1.2 毫米，纹状体→前 2.0-2.2 毫米，外侧 1.5 毫米。可以稍微调整坐标以补偿幼崽的年龄（例如，P0 与 P2）或小鼠的品系（例如，CD1 小鼠大于 P2 处的 C57/B6）。
- 降低微量移液器，直到它在皮肤上形成一个小凹面。然后用力但轻轻地转动 z 轴机械手旋钮，驱动微量移液器穿过皮肤和头骨进入大脑。当微量移液器进入大脑时，颅骨上的压力会被释放，凹陷就会消失。
- 稍微缩回微量移液器，直到吸头被形状像帐篷的圆锥形皮肤包围。沿 z 轴读取坐标：这将是 z 轴零点。
- 将微量移液器降低到所需深度：皮质→ 0.75-1.0 毫米，海马体→ 1.2-1.5 毫米，纹状体→ 2.0-2.5 毫米。可以稍微调整深度以补偿幼犬的年龄或应变。
- 使用上述 Nanoject III 程序注射细胞悬液。注射程序完成后，等待 15-20 秒，然后缓慢缩回微量移液器，以尽量减少溶液从注射部位泄漏。
- 如果进行双侧注射，请将微量移液器重新归零 lambda 上方，并移动到另一个半球的正确坐标。或者，可以通过将微量移液器移动到第一次注射的前方 1 毫米，在同一半球的皮层中进行两次注射。
- 移植完成后，撕下胶带并将幼犬转移到加热垫上。如有必要，用剪尾或脚趾来标记幼犬。一旦幼犬重新获得红色并开始移动，就将其与母亲一起放回笼子里。