电穿孔介导的小鼠背根神经节转染以促进感觉轴突再生

摘要

来源：Li, Q. et al. 研究哺乳动物轴突再生：成年小鼠背根神经节的体内电穿孔。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了通过电穿孔介导的转染技术转染小鼠背根神经节（DRG）神经元，以研究轴突再生。视频概述了向DRG神经元递送核酸构建体、诱导坐骨神经损伤以及评估轴突再生的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 背根神经节（DRG）注射
   1. 腹腔注射麻醉液（将Avertin用无菌生理盐水稀释至终浓度20 mg/mL，剂量为200 mg/kg体重），在DRG注射前维持麻醉状态。
   2. 将脱氧核糖核酸（DNA）质粒或核糖核酸（RNA）寡核苷酸（每DRG 1 µL）吸入玻璃毛细移液管中。
   3. 小心地将玻璃毛细移液管尖端插入DRG内。
   4. 使用细胞内微注射分配系统（30 psi，8 ms）缓慢向DRG内注射1.0 µL的DNA质粒或RNA寡核苷酸溶液。
      注意：注射过程应持续不少于5分钟。
2. 电穿孔
   1. 在电极尖端滴加磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 用无菌方块棉纱布清除出血。
   3. 轻轻用电极夹住目标DRG，并使用电穿孔系统施加5次方波电脉冲。
   4. 分别用5-0尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层。
   5. 将小鼠置于加热毯（35.0 °C）上密切观察，直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回原笼。
      注意：小鼠在37 °C加热毯上完全恢复麻醉大约需要60分钟。将一片（200 mg）布洛芬溶于1,000 ml水中（0.2 mg/ml），用于日常饮水以缓解术后疼痛。
3. 坐骨神经压榨损伤
   1. 根据实验设计，在DRG电穿孔后2至3天，通过腹腔注射麻醉液（Avertin剂量为400 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。
   2. 将小鼠四肢用胶带固定在软木板上。
   3. 沿中线左侧0.5 cm处做1 cm长切口，纵向切开臀大肌和梨状肌等肌肉组织，暴露坐骨大孔与坐骨切迹之间的坐骨神经节段。
   4. 用显微外科镊子压榨神经12秒，并用10-0尼龙表层神经外膜缝线标记压榨部位。在硬膜上打结以标记压榨位置。
   5. 用5-0尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层。
   6. 将小鼠置于加热毯（35.0 °C）上密切观察，直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回原笼。
      注意：小鼠在37 °C加热毯上完全恢复麻醉大约需要60分钟。将一片（200 mg）布洛芬溶于1,000 ml水中（0.2 mg/ml），用于日常饮水以缓解术后疼痛。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 方波电穿孔系统	BTX Harvard Apparatus	45-0052	用于体内电穿孔
镊状电极（Tweezertrodes electrodes）	BTX Harvard Apparatus	45-0524	用于体内电穿孔，1 mm 平头
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	细胞内微量注射给液系统
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1902328
体视解剖显微镜	Leica	M80
显微外科镊	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	仅用于坐骨神经压伤
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm，标准管壁
胶带	Fisherbrand	15-901-30	用于将小鼠固定在软木板上
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin 储存液
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463	Avertin 储存液
siRNA 荧光通用阴性对照 #1	Sigma-Aldrich	SIC003	非靶向荧光标记 siRNA
携带 Dy547 的 microRNA 模拟物转染对照	Dharmacon	CP-004500-01-05	非靶向荧光标记 microRNA
质粒制备试剂盒	Invitrogen Purelink	K210016	用于制备编码 GFP 的质粒
快绿染料（Fast Green Dye）	Millipore-Sigma	F7252	便于注射时更清晰地观察背根神经节轮廓
氯胺酮	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	麻醉诱导
赛拉嗪	AnaSed	NDC 59399-110-20	麻醉诱导
对乙酰氨基酚	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	术后镇痛