在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

摘要

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了在清醒小鼠的脑脊液（CSF）中进行腺相关病毒（AAV）鞘内注射的操作步骤，包括注射器的准备、脊柱的定位以及针头的精确插入。该方法可验证基因靶向递送的效果，为其在中枢神经系统（CNS）治疗中的应用潜力提供支持。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 20% 盐酸利多卡因储备液的配制

1. 称取2 g盐酸利多卡因，加入5–6 mL无菌水，轻轻涡旋混匀，再用无菌水定容至10 mL。
2. 将储备液经0.2微米滤器过滤，按每管1 mL分装至1.5 mL离心管中，用封口膜密封，4 °C保存。

2. 在清醒小鼠中进行直接鞘内AAV递送

1. 使用含70%乙醇的无菌纱布擦拭工作区域，并准备好所需物品。
2. 通过将95 µL的rAAVrh10储存液（5 x 10¹² 基因组拷贝/mL）加入无菌的200 µL微量离心管中，再加入5 µL的20%盐酸利多卡因储存液，配制100 µL的AAVrh.10/1%盐酸利多卡因复合物。用移液器反复吹打混匀。随后将病毒溶液置于冰上（4 °C）保存。
   注意：每只小鼠使用8 µL。
3. 准备用于注射的含AAV溶液的注射器
   1. 装配一支带有27 G针头的25 µL Hamilton注射器，并将针头斜面与注射器上的体积刻度对齐。
   2. 轻柔地吸取8 µL病毒溶液（含4 x 10¹⁰ 基因组拷贝）至注射器中，确保去除气泡。
4. 准备小鼠
   注意：本研究使用雄性或雌性FVB/NJ小鼠（30–70日龄）。鞘内注射在生物安全柜中进行。
   1. 用70%乙醇对生物安全柜内的工作区域进行消毒。将清醒的小鼠（雄性或雌性，30–70日龄，体重13–20 g）以俯卧位放置于生物安全柜内的垫片上。用无菌纱布覆盖其上半身以安抚小鼠并防止被咬伤。
   2. 用一只手的拇指在一侧、食指和中指在另一侧适当而牢固地抓住小鼠的骨盆带以固定动物。用拇指和食指绷紧双侧骨盆带之间的皮肤。用手掌轻轻托住动物的上半身。
   3. 剃除双侧骨盆带之间背部的毛发，然后用含碘消毒剂和70%乙醇对皮肤表面进行消毒。
5. 鞘内注射
   1. 用另一只手的拇指或食指沿双侧骨盆带之间的中线触摸椎间隙，并用指甲轻压形成凹痕，以标示L5-L6椎间隙（确定注射位点）。
   2. 轻微且轻柔地旋转尾巴基部以标示脊柱中线。注射前将针头斜面朝向动物头部。
   3. 确保动物被牢固固定，并将针头沿脊柱中线对齐。
   4. 在凹痕交点处轻柔且垂直（或略微倾斜70–80°）插入针头，保持注射器处于正中矢状面。当针尖接触骨骼时，缓慢减小角度至约30°，然后将针头滑入椎间隙。
      注意：明显的突然尾部抽动是成功进入硬膜内的标志。一旦针头进入椎间隙，针尖会感觉被牢固夹住。本研究使用的27 G针头适用于小鼠鞘内给药，但不适用于大鼠。
   5. 注射载体溶液。启动计时器，以1 µL/4 s的速度注射8 µL载体溶液。注射完成后保留针头约1分钟。撤针时轻轻旋转，以避免液体渗漏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FVB/NJ 小鼠	查尔斯河实验室中国公司
盐酸利多卡因一水合物	HEOWNS	73-78-9
AAV	马萨诸塞大学医学院基因治疗中心病毒载体核心实验室
25µL 汉密尔顿注射器/27-30g 针头	GASTIGHT	1702
70% 乙醇	WEN ZHI
纱布	Wei AN	5171112	8cm*10cm*12cm