在本实验方案中，我们描述了在小鼠妊娠第10.5天时分离胎盘组织，并通过Percoll梯度分离滋养层细胞的方法。随后，我们展示了将分离得到的细胞用于Matrigel侵袭实验的操作过程。
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本文内容
摘要
摘要
胎盘负责向胎儿转运营养物质、气体和生长因子，同时也参与代谢废物的清除。因此，胎盘发育缺陷对胎儿和母体均具有重要影响，并是导致胚胎致死的主要原因之一。胎盘的胎儿部分主要由滋养层细胞构成。原代小鼠胎盘滋养层细胞是研究正常与异常胎盘发育的有力工具；与细胞系不同，这类细胞可被分离并用于研究妊娠特定阶段的滋养层细胞特性。此外，利用转基因小鼠来源的滋养层细胞原代培养，可进一步探究特定基因在胎盘细胞中的功能。本文所述实验方案基于Thordarson的描述 等1，其中使用Percoll梯度从分离的小鼠胎盘中获得相对纯的滋养层细胞群体。该方法与更常用的人类滋养层细胞分离方法类似。2-3纯度可通过对分离细胞进行细胞角蛋白7的免疫细胞化学染色来评估4随后，利用基质胶侵袭实验对分离的细胞进行分析，以评估滋养层细胞的侵袭能力。 体外5-6通过免疫细胞化学分析被侵袭的细胞，并进行染色以计数。
方案
1. 小鼠胎盘的解剖
- 设置小鼠交配对。
- 在接下来的每一天检查是否存在交配栓。检测到交配栓的当天记为交配后0.5天（dpc）7。
- 可在妊娠所需阶段收集胎盘，自妊娠第10.5天成熟胎盘形成起即可进行干净的胎盘解剖。本文以交配后14.5天（14.5 dpc）为例。按所述体积，10.5 dpc时取40–60个胎盘，或14.5 dpc时取10–20个胎盘，均可获得清晰可见的滋养层细胞层。
- 处死妊娠小鼠，切除子宫，于宫颈处及子宫系膜侧进行切割。
- 使用锋利剪刀，在每个胚囊之间剪开（图1A）。
- 用两把镊子夹住切口边缘的子宫壁并拉开，去除肌层（图1B）。建议使用一把锯齿状、中等精细（弯或直）镊子，搭配一把极精细镊子（例如#5镊子）。
- 在胎盘对侧，用镊子或剪刀打开蜕膜，暴露胎盘。用一对镊子夹住子宫组织，另一把镊子从胎盘下方滑入以分离胎盘（图1C）。必要时，将胎儿及胎儿膜与胎盘分离。通过解剖无法在不损失胎盘组织的情况下完全去除所有蜕膜组织，但可用镊子轻轻剥离胎盘表面残留的蜕膜组织（颜色较浅）。后续将依赖Percoll梯度进一步纯化。
- 将每份解剖所得胎盘置于50 ml锥形管中，加入25 ml冰上预冷的消化缓冲液，直至完成全部解剖。在较晚阶段，转移至消化缓冲液前，可用剪刀或刀片将胎盘组织粗略剪碎。
2. 滋养层细胞的分离
- 将锥形管松开管盖后置于37°C水浴中45-60分钟。每约10分钟用移液器剧烈吹打消化液一次。总消化时间需密切监控，通常需要经过若干次尝试与调整才能达到最佳的细胞回收效果。组织应能通过10 ml移液管，但仍会残留可见的组织碎片。过度消化将导致细胞存活率和贴壁效率下降。当存在少量细胞团簇而非完全解离时，细胞存活率和贴壁效率最佳。相反，消化不足则会导致Percoll分离后纯度降低。当达到合适的消化程度时，立即将管子置于冰上以终止胶原酶活性。
- 将溶液通过细胞筛网过滤以去除未消化的组织成分，然后在500 × g条件下离心5分钟。
- 洗涤时，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml洗涤液中，再在500 × g条件下离心5分钟。
- 在离心过程中，于适合高速离心的50 ml离心管中配制Percoll溶液：加入9.6 ml Percoll、13.4 ml洗涤液和1.1 ml 10倍浓度的Medium 199。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml洗涤液中。
- 将细胞加入Percoll溶液中，在4°C下以30,000 × g离心30分钟。
- 从离心机中取出离心管时避免扰动形成的密度梯度。为观察梯度，可将离心管置于强光源前。确定滋养层细胞条带位置（图2），用移液器小心吸取该条带，注意不要扰动下方的红细胞层。滋养层细胞条带体积约为5–8 ml。
- 将滋养层细胞转移至一个50 ml锥形管中，并加入洗涤液至总体积为45 ml。
- 在500 × g条件下离心5分钟。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于培养基（NCTC-135）中。细胞可在薄层Matrigel或组织培养级塑料器皿中，于37°C、5% CO2条件下进行培养。在妊娠第10.5天，每份胎盘大约可获得50,000个活细胞，其中80–90%为细胞角蛋白阳性。
3. 滋养层细胞侵袭实验
- 向每个 Matrigel 小室中加入 1-2 ml 培养基（NCTC-135），在 37°C、5% CO2 条件下孵育 30-90 分钟。
- 移除培养基，将 2 ml 培养基中含 1.5 × 105 个新鲜分离的细胞加入上室，下室中加入 1 ml 培养基以覆盖下层膜表面。
- 在插入式小室中培养细胞 18-24 小时。
- 使用泡沫拭子刮除插入小室上的细胞和 Matrigel。
- 用 2 ml PBS 冲洗小室的顶部和底部。
- 用含 1 ml 4% 多聚甲醛的 PBS 固定 5 分钟。
- 向下室中加入 400 μl DAPI（300 nM）进行染色，并孵育 30 分钟。
- 在 PBS 中短暂洗涤三次。
- 使用锋利的手术刀片将膜从插入小室上切除。
- 在载玻片上滴加 10 μl 封片介质（PBS 中含 50% 甘油）。用镊子将膜置于液滴上，再滴加另一滴 10 μl 介质，然后小心加盖盖玻片。
- 拍摄图像并计数细胞。务必根据所用显微镜的要求正确放置膜的方向（细胞面朝上或细胞面朝下）。Image J 软件（美国国立卫生研究院）包含可用于此目的的手动计数功能，Adobe Photoshop 或手动计数器也可使用。
4. 代表性结果
图 1. 小鼠胎盘的解剖。（a）沿输卵管（黄色）、子宫中膜面以及宫颈（底部）剪开，将子宫取出。然后如图所示用剪刀将各个胚泡分离。（b）将两把镊子插入已切开的子宫壁内表面，从靠近胎儿而远离胎盘的对中膜侧撕开，以去除子宫壁组织。（c）用镊子夹住胎盘，并将另一把镊子插入胎盘与子宫组织之间滑动，从而分离胎盘。随后可将脐带及其他胚外膜与胎盘分离。
图2. 滋养层细胞的Percoll分离。离心后，将出现三个主要条带，如左侧示意图和右侧照片所示。上层条带包含细胞碎片和成纤维细胞，最为明显。在底部附近可见一个致密的（红色）条带，含有红细胞，位于弥散状滋养层细胞条带的正下方。在滋养层细胞条带中可能观察到细胞聚集体，如照片中箭头左侧所示的两个聚集体。
图3. 侵袭性滋养层细胞（白色箭头）将穿过Matrigel层和膜上的孔，在膜的底面出现。孔也可见（黑色箭头）。可计数整个膜表面或代表性取样区域的细胞数量。荧光DAPI核染色的灰度图像已被反相，以增强细胞的可视性。
图 4.通过细胞角蛋白 7（中间，品红色）免疫染色可识别滋养层细胞，并评估分离细胞群体的纯度。细胞经 DAPI 复染（顶部，蓝色）。合并图像位于底部。
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讨论
在本视频中，我们演示了从小鼠胎盘中分离滋养层细胞的方法。随后展示了滋养层细胞体外侵袭实验。通过该方法，可获得纯度较高但并非完全纯净的滋养层细胞群体。若需要更高的纯度，可进一步采用磁珠分选或流式细胞术，正如已有文献报道的原代人滋养层细胞分离方法。每次实验中胶原酶消化步骤的合适时长需根据具体情况确定，并通过经验积累掌握。消化过度会显著降低细胞回收率，而消化不足则可能导致细胞纯度降低，同时细胞数量也会减少。尽管我们展示了使用商品化预包被Matrigel的侵袭小室，但也可通过将Matrigel以所需厚度涂布于未包被的Transwell小室中自行制备。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢密苏里大学学术支持中心创意服务团队为制作本视频所提供的帮助。 本研究由美国国立卫生研究院尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所资助，资助号 HD055231
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参考文献
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- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
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