小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

摘要

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp. (2015)

该视频介绍了在小鼠模型中将病毒载体注射至视网膜色素上皮（RPE）下腔的方法。详细描述了从麻醉和眼部准备到精确递送慢病毒载体的整个操作流程，以确保目的基因在RPE细胞中的整合与表达。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备注射试剂盒和病毒载体

1. 准备一支配备经环氧乙烷气体灭菌的33 G钝头针头的微升注射器。在微量离心管中用PBS（磷酸盐缓冲液）稀释病毒载体，以获得适当的滴度即， 1 × 10⁶ TU/µl）。用病毒载体反复冲洗注射器数次，以去除注射器内的死腔。

2. 病毒载体的视网膜下注射

1. 麻醉成年小鼠（即， 6至8周龄）小鼠腹腔注射替来他明与唑拉西泮混合物（1:1，2.25 mg/kg体重）和盐酸赛拉嗪（0.7 mg/kg体重），或采用其他合适的麻醉方案。
2. 使用0.5%的苯肾上腺素和0.5%的托吡卡胺滴眼液散瞳。
3. 用1.5–2 µl病毒载体溶液预装微量注射器。
4. 打开眼睑并突出眼球，以暴露赤道部，便于注射。在手术显微镜下对准目标位置。保持眼球突出状态直至完成注射，否则可能导致注射过程中针头移位。为稳固固定眼球，应将手指置于眶缘外侧。
5. 在角膜表面滴加一滴眼用粘弹剂溶液。
6. 将一小片圆形盖玻片置于角膜上方以观察视网膜。
7. 在角膜缘稍偏后方用无菌30 G 1/2针头刺一小孔，以备后续视网膜下注射。为方便操作，右眼选择下方位置刺孔，左眼选择上方位置刺孔。
   注意： 若穿刺孔位于颞侧或鼻侧，则注射后难以被眼睑覆盖。初始穿刺应稍偏角膜缘后方进行，以避开沿角膜缘走行且易于辨认的角膜缘血管。穿刺时需小心避免针头触碰晶状体。进针时不要将整个针尖斜面插入，以防刺破晶状体。
8. 将微量注射器的33G钝针经预先穿刺的孔洞插入，进入视网膜下腔，直至感到轻微阻力。
   注意： 对于视网膜下注射，针头与虹膜平面的最佳进针角度约为45度，应将钝头针头向视盘周围区域方向向后推进。虚线方框表示建议的经玻璃体腔针头路径，用于视网膜下注射 图1.
   注意： 刺入（或穿过）视网膜各层时不会感到阻力，因为这些组织非常柔软。因此，当首次感受到轻微阻力时，表明针尖已接触到视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium, RPE）层，此时应停止继续进针。需注意避免因施加过大压力而穿透巩膜组织，因为针头应置于潜在的视网膜下腔隙内。若因用力过大导致针头穿破巩膜，则会无阻力地进入眼外眶内空间。 （此步骤至关重要）
9. 注射病毒载体（例如， 1 × 10⁶ TU/µl）轻柔地注入视网膜下腔，操作时避免震颤，以防造成不必要的组织损伤。随后，轻柔撤出针头。注射过程中应牢固固定眼球，具体操作如2.4节所述。
10. 在手术显微镜下观察注射后视网膜下隆起的形成情况，以确保无视网膜出血。

结果

图1. 视网膜下注射示意图。小鼠眼球的H&E（苏木精和伊红染色）染色横截面，显示了视网膜下注射的针道路径（以虚线方框标示）。放大倍数：40X，比例尺：500 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子 DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm 尖端	WPI	500233
VANNAS 剪刀 S/S，105mm	WPI	555583S
33G 钝头针	WPI	NF33BL-2
NanoFil 注射器，10 微升	WPI	NANOFIL
RPE-KIT	WPI	RPE-KIT	用于单手便捷注射
30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlide™ 针头	BD	305107	用于视网膜下注射的初始穿刺
显微镜盖玻片（No. 1，直径 3 mm）	Warner Instruments	64-0720 (CS-3R)
Leica 手术显微镜	Leica	LM M80
荧光显微镜	Nikon	Eclipse 80i
慢病毒	Thermo Scientific	TMO.LV-Ctr	用于稀释载体
PBS	Gibco	10010-015	用于稀释载体
托吡卡胺（去氧肾上腺素 0.5% - 托吡卡胺 0.5%）	Hanmi		用于散瞳
盐酸丙帕他卡因眼科溶液 USP，0.5%（无菌）	Bausch&Lomb		用于表面麻醉
Healon GV 眼用粘弹剂	Abbott Medical Optics Inc.
Zoletil 50（盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮）	Virbac		用于全身麻醉
Rompun® 注射液（盐酸赛拉嗪）	Bayer		用于全身麻醉