使用石英微针的啮齿动物脑显微注射

摘要

资料来源：Paolone， G. 等人。用于啮齿动物大脑显微注射的个性化针头。J. Vis. Exp.（2018）。

该视频演示了使用带孔的石英微针进行啮齿动物脑微针注射。微针连接到注射器和微泵上以控制输送速率。将装有注射液的针头插入大脑，输送速度设置为较低。一旦定位，交付速度就会提高。短暂停顿后，针被拔出。

方案

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1.石英针的制备

1. 将石英毛细管（参见 材料表）清洁和灭菌，方法是将它们放入蒸馏水中 5 分钟，在 99% 乙醇中放置 5 分钟，在二乙醚中放置 5 分钟。
将
2. 毛细血管留在引擎盖下至少 1 小时，让它们完全干燥。
根据个人需要，根据允许
3. 生产足够长、足够细的针头的参数，使用激光拉拔器准备针头。
   注意：我们使用激光拉拔器（参见 材料表）。使用两行程序进行拉动。第一条线使用功率大，扫描长度最大（对应于FILAMENT'S VALUE），无拉力。这种参数组合导致毛细管的最大部分以最低的延伸速度熔化，从而可以成型具有较大内部/外部尺寸和减小柄的长针。通过这种方式，针头保持了高机械阻力和宽内径，允许干细胞或病毒颗粒通过而不会堵塞。该程序线的速度和延迟应在尖端变得太小和太长之前停止毛细管延伸，从而缺少所需的机械和形状特性。一旦石英冷却（5 秒），拉动程序的第二行就会自动执行。功率、灯丝和拉力参数可用于切割具有尽可能短的尖端长度和陡峭刀柄的尖端，避免两根针因尖端破裂而分离。通常，对于我们的设备，我们使用以下内容：（a） 线 1 = 功率 990，灯丝 5，速度 130，延迟 110，拉力 0;（b） 线 2 = 功率 970，灯丝 3，速度 0，延迟 70，拉力 0。
将
4. 针头放入预先用 70% 乙醇清洁的培养皿中。
   1. 用塑料石蜡薄膜盖住盘子。
5. 用显微解剖器切割毛细血管。
   1. 在启动时，让激光器运行自动校准过程以验证传递的功率和能量。然后，设置切割参数。
      注意：我们使用显微剖析器（参见 材料表）和以下参数：激光功率脉冲能量（63μJ），最大孔径的20%的激光束直径（最大孔径：1.0μm）和最大速度的10%的切割速度（最大速度：30μm/s）。
   将
   2. 针头牢固地固定在显微镜台上，并将其尖端放在电脑屏幕的中央。
   在
   3. 菜单栏上，单击铅笔图标并使用它为针的激光切割绘制标记。
      注意：切割应与针表面成约 45° 角。
   4. 在侧边栏功能上，选择包含"START CUT"按钮的标志，以允许激光切割先前标记的点。
   5. 如果需要，通过重复 1.5.2-3 中描述的步骤切割侧孔;无需重新定位针头（图 1）。
6. 切割后清洁。
   1. 通过塑料管将针头连接到空泵。
   打开
   2. 泵并手动将正向流速设置为中等速度 （3 μL/min）。
   3. 先吸出99%的乙醇，再吸出蒸馏水，以去除因切割而产生的杂质。
   4. 再次吸出 99% 乙醇以促进干燥。
      注意：每个步骤应至少持续 3 分钟。
将
7. 针头存放在适当覆盖的培养皿中，直到手术当天。
8. 针头可以重复使用;在实验结束时，用漂白剂和乙醇清洁以去除溶液和可能的组织残留物。为了更彻底的清洁，将针头放入微量移液器储存罐中，尖端朝下，用蒸馏水填充罐，直到尖端被覆盖，煮沸 1.5 分钟以去除任何残留的组织，然后用乙醇清洗。

2. 程序

按照

1. 泵用户手册提供的说明，选择设置菜单，根据显微注射注射器的直径/体积校准泵，并将流速设置为 0.3 μL/min。
用
2. 无菌水填充装有钝针（例如汉密尔顿针，30 G）和短聚四氟乙烯管的 10 mL 注射器，并用它填充显微注射注射器（在非常小心地移除活塞后）和手动显微注射泵 （MMP） 的注射组件套件。
   注意：MMP 套件用于将针头牢固地安装在立体定向框架中（图 2).该套件包括一个聚四氟乙烯管、一个鲁尔-管接头、一个移液器支架和用于不同外径移液器的垫圈。
将
3. 针头连接到 MMP 套件。
   1. 通过 10 mL 注射器冲洗整个系统中的更多水，并检查水是否从针头中流出。
      注意：确保通过重复填充步骤去除系统内的任何气泡。
断
4. 开 10 mL 注射器与显微注射注射器的连接，同时缓慢推动活塞，以便在显微注射注射器顶部留下一滴水。将活塞插入显微注射注射器中。
将
5. 显微注射注射器连接到泵并将流速设置为 0.3 μL/min.
   注意：等到有一滴从针尖泄漏，然后再放开 3 分钟。
6. 将流量设置为 0.1 μL/min 并开始手术程序。泵在进行手术时应运行。
   注意：对于本文报告的实验，我们使用300克（3个月龄）的雄性Sprague Dawley大鼠。但是，该程序适用于其他物种，尤其是小鼠。
7. 使用当地法规批准的方法诱导全身麻醉。
   注意：我们使用 85 mg/kg 氯胺酮和 8 mg/kg 甲苯噻嗪的腹腔注射 （ip） 混合物进行 20-50 分钟的麻醉。重要的是，使用尾巴和/或脚趾捏住以确保动物完全镇静。在手术开始前评估麻醉水平和基本生命体征，并在进行手术时每 10 分钟监测一次。使用水再循环加热垫在手术前、手术中和手术后保持动物体温恒定。对动物进行监测，直到完全康复（例如，它们直立且可以走动）。此外，动物在术后每 24 小时接受一次镇痛药（曲马多，5-7 mg/kg ip），持续三天。
   剃掉
   1. 动物的头部，并为无菌手术做好充分的手术部位准备。用碘溶液（Betadine）进行两阶段擦洗，然后用 70% 乙醇擦洗。此外，为了保持无菌，请用手术单包裹手术部位（在视频中出于演示目的省略了）。
将
8. 大鼠放在立体定位框架中，放在水再循环加热毯上。为了提供额外的疼痛缓解，在手术部位涂抹 0.5% 利多卡因溶液（不超过 7 mg/kg）。使用珠子灭菌器或液体冷消毒对所有手术器械进行预灭菌，方法是将设备浸入 2% 戊二醛加 7.05% 苯酚（Sporodicin 或 Cidex）中，然后用无菌水或生理盐水冲洗。即使在手术之间也必须进行消毒。使用消毒过的手术刀在头骨上做一个纵向切口。轻柔以避免出血过多。用扁平抹刀打开头皮，并在皮瓣上贴上手术夹以保持头皮张开。非常轻柔地，分离骨膜以露出前束和针头将插入的颅骨区域。
将
9. 手臂安装在立体定向框架上（当流动进行时）并将针尖准确地移动到前胆的顶部，注意不要折断其尖端。注释前萵的前后和中外侧坐标并转换为所需的坐标。在立体显微镜的引导下，降低针头，直到其尖端几乎接触颅骨，稍微抬起立体定位臂后标记钻孔点。
钻
10. 头（钻头直径：0.8 毫米;钻头速度：1,000 转/分）在标记点上打头骨。在钻孔过程中必须注意不要穿透硬脑膜。钻孔时，滴入无菌生理盐水，以免骨损伤和坏死。
11. 剪下一小块塑料石蜡薄膜，放在头骨上。使用10μL移液器，滴一滴溶液以注射到塑料石蜡薄膜上。停止泵，轻轻收回泵的推动器，轻轻拉动显微注射注射器的活塞，在毛细管中产生一点气泡。
12. 降低立体定向臂，直到针尖到达液滴。通过拉动（非常缓慢）显微注射注射器的活塞来抽取样品，避免形成任何气泡。更换与活塞接触的泵推杆，并以 0.3 μL/min 的流速打开泵。等待液滴形成（几分钟），然后再进行下一步。
    注意：在本例实验中，人工脑脊液（aCSF）输注纹状体[AP（前后）：+1.5，ML（中外侧）：±2.7;DV（背腹侧）：-5.0]和背侧海马体（AP：-3.5，ML：±2.1;日差：-3.5;以硬脑硬脑膜的毫米为单位），2 μL/位点。为了便于比较两种注射方法，在一个半球使用石英针，在另一个半球使用26 G钝头或30 G斜头不锈钢针头输注每个大脑区域。
将
13. 流量降低至0.1μL / min，用不锈钢斜尖针在硬脑膜上划口，然后缓慢降低背腹轴上的立体定向臂，进入脑组织。当达到所需位置时，再下降 0.1 毫米，停止泵，将立体定向臂抬高 0.1 毫米，然后以流量再次启动泵至 0.3 μL/min.
    注意：在降低针头时保持缓慢流量的原因是确保正压，避免针头本身的小组织碎片穿透。这样的事件会阻塞尖端，损害溶液的输送。由于降低针头时流速非常慢，下降速度约为 10 s/mm，这意味着与注射到目标部位的溶液相比，沿针迹残留的溶液量可以忽略不计。使用带侧孔的针头时，可以避免此预防措施。
14. 启动定时器并等待所需的时间，具体取决于所需的进样体积（例如，如果进样 2 μL，则为 6 分 40 秒）。注射时监测气泡运动。最后，停止泵并等待 5 分钟，然后慢慢取出针头。当石英针完全拔出后，再次启动泵并检查针尖处是否形成水滴。
15. 用骨蜡密封颅骨表面的开口，取下止血夹并缝合头皮，用抗生素乳膏（例如新孢菌素）覆盖伤口周围的区域，然后将动物放回家庭笼子。

结果

图 1：石英针尖的显微图像，显示了用于注入流体的尖端和孔的不同直径。（A）中的低放大倍率图像和（B）和（C）中的高放大倍率。根据大脑区域的解剖结构、扩散目标和溶液的粘度，针头可以以不同的方式制备（不同的长度、孔数和孔尺寸），如（B）和（C）所示。请注意使用低功率激光显微切割获得的孔和尖端的平滑切割。

材料